肝移植術后患者外周血T細胞內ATP與T細胞亞群聯合檢測對免疫功能的監測作用

劉偉，李代紅，王凱，劉純(天津市第一中心醫院，天津300192)

劉偉，李代紅，王凱，劉純
(天津市第一中心醫院，天津300192)

摘要:目的探討肝移植術后患者外周血T淋巴細胞內ATP水平和T細胞亞群聯合檢測對免疫功能的監測作用。方法選擇肝移植術后患者80例，其中術后病情穩定30例(穩定組)、出現感染30例(感染組)，發生急性排異反應20例(排異組)，另選健康體檢者30例作為對照組。采用Cylex+ ImmuKnow方法檢測T淋巴細胞內ATP，流式細胞術檢測T細胞亞群，比較各組ATP及T細胞亞群的變化情況，分析二者的相關性。結果感染組ATP明顯低于穩定組和對照組，排異組ATP明顯高于穩定組和對照組(P均＜0.05)。與穩定組比較，排異組受者外周血T淋巴細胞百分比及/均明顯升高(P均＜0.05)。與穩定組比較，感染組受者外周血T淋巴細胞百分比及/明顯降低(P均＜0.05)。感染組與ATP呈正相關，/與ATP無相關性;排異組/與ATP呈正相關和與ATP無相關性。感染組感染治愈后ATP明顯回升，排異組在急性排異反應治愈后ATP明顯下降(P＜0.05)。結論肝移植術后聯合檢測T細胞ATP和T淋巴細胞亞群，對判斷肝移植受者的免疫狀態、移植后感染和誘導免疫耐受均有重要作用。

關鍵詞:肝移植; ATP; T細胞亞群;感染;排異反應;器官移植;免疫功能

Key words: liver transplantation; ATP; T-lymphocyte subsets; infection; rejection; organ transplantation; immune function

肝臟移植是治療終末期肝病惟一有效的方法，準確客觀地評價肝移植受者術后的免疫狀態有助于免疫抑制劑的合理應用。采用ImmuKnow技術檢測T細胞內ATP水平，能夠快捷、準確地評估免疫抑制人群整體細胞免疫功能狀態［1］。T細胞亞群也可用于移植后免疫功能監測，T淋巴細胞絕對計數過低易導致嚴重的感染，/過高易導致排異反應的發生［2］。本研究通過檢測肝移植術后患者外周血中T細胞內ATP水平和T細胞亞群，探討這兩種指標對免疫功能的監測作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2011年1月～2014年6月在我院行肝移植術后隨訪患者80例，男58例、女22例，年齡22～67(48.0±11.3)歲，隨訪時間0.5～3.0年。原發病為乙肝后肝硬化56例，原發性肝癌5例，重癥肝炎17例，丙肝后肝硬化2例。其中術后病情穩定30例(穩定組)、出現感染30例(感染組)、發生急性排異反應20例(排異組)。另選健康體檢者30例作為對照組，男21例、女9例，年齡25～41(33.6± 8.9)歲。各組性別、年齡具有可比性。

1.2觀察指標檢測穩定組術后1年，感染組和排異組術后1、2、6個月，發生感染或急性排異反應時，發生感染或急性排異反應治愈后1個月及對照組入組時的外周血T細胞內ATP水平，以術后1、2、6個月ATP均值作為術后隨訪均值;檢測感染組和排異組發生感染或急性排異反應時、穩定組術后1年外周血T細胞亞群。

1.2.1T淋巴細胞內ATP檢測采用Cylex+ ImmuKnow方法。采集受試者空腹外周血，肝素鈉抗凝，加入植物血凝素，37℃、5% CO2共孵育15～18 h。向標本中加入耦聯磁珠的抗CD4單克隆抗體，分離出T細胞。加入細胞裂解液，裂解T細胞并使其釋放細胞內ATP。加入發光試劑，用熒光光度計測量吸光度值，測3次計算均值，用標準曲線換算ATP的質量濃度。

1.2.2T細胞亞群檢測采用流式細胞術。采集受試者空腹外周血，EDTA抗凝。根據需要檢測的T細胞的不同亞群，向試管中加入相應的熒光標記單抗，混勻，室溫避光孵育15 min。加入紅細胞裂解液1 mL，避光放置10 min，待紅細胞裂解完全后，離心棄上清液，加入PBS 0.4 mL，上流式細胞儀檢測，使用配套軟件計算、所占百分比及/。

1.3統計學方法采用SPSS18.0統計軟件。計量資料多組間均數比較采用方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CD4T淋巴細胞內ATP水平穩定組術后1年、感染組發生感染時、排異組發生急性排異反應時、對照組入組時的ATP水平分別為(436.3± 165.4)、(195.3±107.4)、(540.6±197.6)、(400.0 ±78.2) ng/mL。感染組明顯低于穩定組和對照組，排異組明顯高于穩定組和對照組(P均＜0.05)。感染組中，24例(80%)發生感染時ATP低于術后隨訪的平均值(感染后1個月)，感染治愈后ATP明顯回升;其余6例變化不明顯。排異組中，9例(45%)發生排異時ATP高于術后隨訪的平均值，排異治愈后ATP明顯下降;其余11例變化不明顯。見表1。

表1　感染組及排異組發生感染或急性排異及治愈后ATP水平比較(±s)

注:與感染(排異)發生時比較，*P＜0.05。

組別　n ATP(ng/mL)感染(排異)發生時術后隨訪均值感染(排異)治愈后感染組　24 195.3±107.4 239.2±117.5*205.4±122.2排異組　9 540.6±197.6 476.3±102.4*496.2±155.4

2.2T細胞亞群見表2。與穩定組比較，排異組發生急性排斥反應時外周血、T淋巴細胞百分比及CD4/CD8均明顯升高(P均＜0.05) ;感染組發生感染時外周血、T淋巴細胞百分比及CD4/CD8均明顯降低(P均＜0.05)。

表2　感染組、排異組、穩定組T細胞亞群比較(±s)

注:與穩定組比較，*P＜0.05。

組別n　T 細胞亞群CD+3(%)　CD+4(%)　CD+4/CD+8感染組　24　50.23±18.51*24.68±13.57*1.32±1.58*排異組　9　86.32±16.78*57.82±17.33*3.65±1.47*穩定組30　72.46±19.56 39.64±11.59　1.87±1.55

2.3ATP與T細胞亞群的相關性相關性分析顯示，感染組、均與ATP呈正相關(r分別為0.815、0.628，P＜0.05)，/與ATP無明顯相關性(r=0.081，P＞0.05) ;排異組/與ATP呈正相關(r=0.789，P＜0.05)和與ATP無相關性(r分別為0.054、0.047，P均＞0.05)。穩定組與ATP無相關性(r分別為0.078、0.061、0.122，P均＞0.05)。

3　討論

對肝移植術后患者，目前常使用藥物濃度監測作為調整免疫抑制劑劑量的標準，但藥物濃度與患者免疫功能之間缺乏良好的相關性［4］，無法準確監測免疫功能，導致很多肝移植受者處于免疫抑制過度狀態，增加了感染、腫瘤和藥物不良反應的發生率［3］。ImmuKnow免疫細胞功能檢測能夠快捷、準確地評估細胞免疫功能狀態，幫助醫生掌握有效血藥濃度范圍［5］。T細胞亞群是評估機體免疫狀態的常用方法，和亞群在急性排異時可發生變化。因此聯合檢測ATP和T細胞亞群對監測肝移植術后患者的感染與排異有一定的診斷意義。

本研究顯示，80例肝移植受者中，感染組ATP明顯低于穩定組和對照組，排異組ATP明顯高于穩定組和對照組，提示肝移植受者ATP與臨床感染、移植肝排異反應存在明顯相關性。T淋巴細胞內ATP水平降低是肝移植術后感染的危險因素，通過檢測ATP水平監測機體的細胞免疫狀態，能彌補藥物濃度監測的不足，指導臨床調整免疫抑制劑的劑量，減少感染發生的風險。研究表明，當移植受者被巨細胞病毒、EB病毒以及肝炎病毒等感染時，細胞介導的免疫力下降，其外周血免疫細胞的ATP水平也隨之下降［7］。多中心臨床試驗結果顯示，肝、肺、小腸、胰腺等移植術后，測定T淋巴細胞內ATP水平，可對器官移值免疫功能進行監測，客觀評價臨床感染、移植物排異反應等風險［8～10］。

本研究對肝移植患者進行術后隨訪，結果顯示感染發生時移植受者ATP低于術后平均水平，感染治愈后ATP明顯回升，表明感染期患者的細胞免疫狀態處于較低的水平;排異反應發生時，肝移植受者的ATP高于術后平均水平，排異治愈后ATP明顯下降，表明排異期患者的細胞免疫狀態處于較高的水平。因此認為，ATP可以很好地反映移植受者當時的免疫狀態。

本研究對感染組、排異組ATP與T細胞亞群的關系進行相關性分析，結果顯示，感染組均與ATP呈正相關，與ATP無相關性;排異組?與ATP呈正相關，和與ATP無明顯相關性。Ahmed等［11］報道，肝移植患者出現術后感染時的?T細胞絕對計數、/均顯著低于術前和感染治愈后，當T細胞絕對計數、明顯上升時預示感染情況好轉。熊海云等［12］認為，動態監測外周血T淋巴細胞亞群的變化對判斷感染、急性排異反應和受者的免疫狀態有一定的意義。但目前肝移植術后的免疫狀態沒有統一的標準，且T淋巴細胞亞群、個體差異明顯，只有與術前、術后的穩定期和病理期縱向動態進行比較才更有意義。

綜上所述，通過檢測T淋巴細胞內ATP與T細胞亞群監測肝移植患者的免疫狀態，既能減少免疫抑制的用量，還能夠減少感染發生的風險，使受者以最少的免疫抑制劑量獲得更長的移植物存活時間。

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·基礎研究·

Monitoring effects of combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes

of peripheral blood on immune function after liver transplantation LIU Wei，LI Dai-hong，WANG Kai，LIU Chun
(First Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300192，China)

Abstract:Objective To investigate the monitoring effects of combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes of peripheral blood on immune function in patients after liver transplantation.Methods Eighty cases of liver transplant recipients，including 30 cases of patients with stable condition after operation (stable group)，30 cases of patients with infection (infection group) and 20 patients with acute rejection (rejection group)，and 30 healthy controls (control group) were selected.The concentrations of ATP inT lymphocytes were detected by Cylex+ ImmuKnow method，and the percentages of T-lymphocyte subsets were determined by flow cytometry.The changes of ATP and T lymphocyte subsets were compared in each group and their correlations were analyzed.Results The ATP level of the infection group was significantly lower than that of the stable and control groups，and the ATP level of the rejection group was significantly higher than that of the stable and control groups (all P＜0.05).Compared with the stable group，the and ?T lymphocyte percentage，/in the peripheral blood of the rejection group were significantly higher (all P＜0.05) ; and theandT lymphocyte percentage，/in the peripheral blood of the infection group were significantly lower (all P＜0.05).In the infection group，andwas positively correlated with ATP，but/had no correlation with ATP.In the rejection group，/was positively correlated with ATP，but? and were not correlated with ATP.The ATP significantly increased after the cure of infection in the infection group，and the ATP significantly decreased after the cure of rejection in the injection group (P＜0.05).ConclusionThe combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes of peripheral blood in patients after liver transplantation have important significance to the judgment of the recipients immune status，infection and induced immune tolerance.

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者簡介:李代紅(1966-)，女，主任技師，主要研究方向為臨床輸血和移植免疫。E-mail: ldh_hla@163.com

作者簡介:第一劉偉(1980-)，女，主管技師，主要研究方向為移植免疫。E-mail: liuwei2024@126.com

基金項目:天津市衛生局科技基金(2013KZ035)。

文章編號:1002-266X(2015)18-0024-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R617

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.008