缺血預處理對下頜下腺缺血再灌注損傷大鼠的保護作用

孫斌，高峻田，石亮，宋代輝，魏奉才(山東大學口腔醫學院，山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南500; 山東大學齊魯醫院，山東大學口腔醫學研究所)

缺血預處理對下頜下腺缺血再灌注損傷大鼠的保護作用

孫斌1，高峻田2，石亮2，宋代輝1，魏奉才2
(1山東大學口腔醫學院，山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南250012; 2山東大學齊魯醫院，山東大學口腔醫學研究所)

摘要:目的觀察缺血預處理(IPC)對下頜下腺缺血再灌注(I/R)損傷大鼠的保護作用，并探討其機制。方法將48只大鼠隨機分為模型組和觀察組各24只，均制作右側下頜下腺I/R損傷模型。觀察組在制模前行IPC，夾閉頜外動脈下頜下腺供血支3 min，再灌注3 min，重復3次。以左側下頜下腺作為對照組。再灌注1、12、24、72 h，取6只大鼠檢測各組腺體分泌量、組織學變化、緊密連接結構及M受體表達情況。結果對照組腺體分泌量、組織形態、緊密連接結構及M受體表達情況均正常。I/R后1、12 h，模型組腺體分泌量明顯降低，觀察組稍有降低，24 h時兩組分泌量開始增加，至72 h逐漸恢復正常。模型組腺實質細胞萎縮，間質水腫及炎癥浸潤，電鏡下超微結構觀察顯示緊密連接結構破壞，寬度降低，均在再灌注12 h后最為嚴重，觀察組部分腺體組織出現上述情況，且反應較輕。模型組I/R后，M受體水平1、12 h下降明顯，觀察組稍有下降，72 h時逐漸恢復。結論IPC對下頜下腺I/R損傷大鼠具有保護作用，其機制與上調下頜下腺M受體的表達、保護下頜下腺緊密連接結構有關。

關鍵詞:缺血預處理;缺血再灌注;下頜下腺;下頜下腺移植;角膜干燥癥

重癥角膜干燥癥(干眼病)多采取血管化自體下頜下腺移植治療。研究顯示，缺血再灌注(I/R)損傷會導致下頜下腺分泌降低，而缺血預處理(IPC)對移植下頜下腺的分泌功能有一定保護作用［1］。為了探討IPC對下頜下腺I/R損傷大鼠的保護作用及其機制，2014年3～9月，我們進行了如下研究。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性Wistar大鼠48只，體質量約200 g，由山東大學動物中心提供。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司) ;冰凍切片機;激光共聚焦顯微鏡(Leica，TCS，SP2) ;透射電子顯微鏡H-7000(Hitachi，Tokyo，日本)。

1.2模型制作及干預方法將大鼠隨機分為模型組和觀察組，各24只，均制作右側下頜下腺I/R損傷模型，以左側下頜下腺作為對照組。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸部正中切口分離肌肉、筋膜，尋找下頜下腺血管、神經及下頜下腺導管束，游離并保護舌神經支配下頜下腺的分支，保留副交感神經的支配作用。夾閉頜外動脈下頜下腺供血支90 min后行再灌注恢復血流。觀察組于制模前行IPC，夾閉頜外動脈下頜下腺供血支3 min，再灌注3 min，重復3次。

1.3相關指標觀察

1.3.1下頜下腺分泌量于再灌注1、12、24、72 h各取6只大鼠，于麻醉狀態下分離損傷側及對照側下頜下腺導管至口底并切斷，于斷端處插入直徑約0.5 mm的聚乙烯塑料小管，行Schirmer試驗測定下頜下腺分泌量，以5 min內濾紙條(35 mm×5 mm)濕潤長度表示，測量3次取均值。

1.3.2下頜下腺組織形態①組織學形態:測定下頜下腺分泌量后，游離大鼠雙側下頜下腺并摘除，各取部分組織用10%中性甲醛固定，水洗、脫水、透明、包埋后切成5 μm厚切片，HE染色后封固，于光學顯微鏡下觀察腺體組織學形態。②緊密連接結構:另取腺體組織塊約1 mm3，2.5%戊二醛固定，切片后用醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，于透射電子顯微鏡下隨機選取10個視野，觀察下頜下腺腺體細胞間緊密連接超微結構，使用圖形測量軟件測量其寬度，取均值。

1.3.3下頜下腺組織M1、M3受體采用免疫熒光法檢測?？筂1、M3受體(1∶100)免疫標記組織切片，4℃孵育過夜。次日取出后室溫下復溫30 min，滴加熒光FITC標記二抗(1∶50) 37℃孵育30 min，滴加DAPI(著染細胞核)孵育3 min，0.01 mmol/L PBS漂洗，封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。M1、M3受體定位于腺泡細胞細胞膜與細胞質中，免疫熒光標記顯示綠色熒光，以綠色熒光信號強度來衡量其表達強弱。

1.4統計學方法采用SAS9.1.3統計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1三組下頜下腺分泌量對照組下頜下腺分泌量正常，各時間點均無明顯變化。I/R后1、12 h，模型組、觀察組腺體分泌量降低，模型組降低更為明顯著(P均＜0.05) ; I/R后24 h兩組下頜下腺分泌量開始增加; I/R后72 h兩組恢復正常。見表1。

表1　三組I/R各時間段下頜下腺分泌量比較(mm，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n 下頜下腺分泌量1 h　12 h　24 h　72 h觀察組　6 3.67±0.25*Δ3.00±0.18*Δ4.00±0.43　3.58±0.30模型組　6 1.75±0.21*1.92±0.24*　4.08±0.30　3.67±0.33對照組6 4.04±0.25　3.83±0.23　3.83±0.21　4.04±0.24

2.2三組下頜下腺組織形態學

2.2.1組織學形態對照組為正常腺泡及導管形態。I/R后1 h模型組腺體實質細胞出現輕度萎縮，間質水腫和充血，可見少量單核細胞;觀察組與對照組形態相近。I/R后12 h模型組腺泡細胞及導管細胞嚴重萎縮，組織水腫明顯，導管系統組織破壞，腺小葉及腺導管中炎癥反應較輕，以早期中性粒細胞為主;觀察組少部分腺體組織出現模型組情況，但反應較輕。I/R后24 h兩組均可見炎癥反應，以少量單核—巨噬細胞為主，組織水腫減輕。I/R后72 h兩組腺體逐漸恢復，腺泡及導管形態恢復正常。

2.2.2緊密連接結構對照組相鄰腺泡上皮細胞間靠近腺泡腔處存在完整、清晰的細胞間緊密連接。I/R后1 h，模型組相鄰腺泡上皮細胞間的緊密連接變模糊，結構開始崩塌，電子密度降低明顯，與對照組相比，細胞間緊密連接的寬度明顯減少(P＜0.05)，I/R后12 h更為明顯(P＜0.01)。觀察組I/R后1、12 h緊密連接寬度減少明顯，但是在電鏡下結構仍較清晰，并且在I/R 后12、24 h與模型組相比P＜0.05。I/R后24 h觀察組與模型組細胞間緊密連接電子強度逐漸增加，至72 h兩組相鄰腺泡上皮細胞間緊密連接的超微結構逐漸恢復成正常的索狀結構。三組細胞緊密連接結構寬度比較見表2。

表2　三組I/R各時間段緊密連接結構寬度比較(nm，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別　n 緊密連接結構寬度1 h　12 h　24 h　72 h觀察組　6　10.74±0.20*10.34±0.30* #12.80±0.22* #16.05±0.27模型組　6　9.64±0.16*　4.02±0.17*　8.66±0.26*　15.19±0.14*對照組　6　17.04±0.63　18.08±0.46　17.46±0.38　16.94±0.51

2.3三組M1、M3受體表達I/R后12 h，模型組M1、M3受體熒光信號信號較對照組明顯下降，觀察組熒光信號強度明顯高于模型組; I/R后24 h模型組與觀察組熒光信號開始明顯升高，72 h時模型組與觀察組的M1、M3受體熒光信號強度逐漸接近對照組。

3　討論

自體下頜下腺移植治療重癥干眼病需經歷I/R的過程，I/R后血管內皮細胞損傷，組織滲出增多，白細胞和巨噬細胞激活，導致多種趨化因子和細胞黏附分子大量生成、釋放，進一步介導下頜下腺局部組織細胞的炎癥損傷。正常頜下腺的分泌主要由交感和副交感神經調節，其中主要由副交感神經末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)通過激活M受體來調控水和電解質分泌。M1、M3受體主要參與腺體水和電解質的分泌，維持并保護腺體的分泌功能［2，3］。研究表明，M受體及其信號通路在I/R引起的腦血管、心臟等疾病表達中均下調，再灌注損傷的組織受到大量活性氧等自由基刺激而造成損害，IPC能有效緩解相應組織損傷［4］。我們的前期研究證實，家兔下頜下腺移植早期M1與M3受體mRNA與蛋白表達及其信號轉導通路均下調。對M受體下游通路進一步研究顯示，自由基清除劑金屬蛋白酶抑制劑(MPI)可阻斷Ach的保護作用，證實適量的活性氧是Ach作用于M受體預處理保護機制的第二信使［5］。唾液是通過旁細胞途徑形成的，研究顯示旁細胞途徑是體外灌注的家兔和大鼠下頜下腺水轉運的主要方式［6］。旁細胞途徑由相鄰細胞之間的連接復合體和細胞間隙組成，緊密連接位于連接復合體的最頂端，是物質通過旁細胞通路轉運的限制因素，具有屏障和柵欄的功能［7］。緊密連接的動態調節是組織器官許多病理生理變化的基礎，如I/R損傷。大量研究發現，在大腦、肺、腸道等器官發生I/R，其相應細胞間的緊密連接都會發生不同程度的損傷［8，9］。本研究觀察了I/R與IPC后大鼠下頜下腺組織在電鏡下緊密連接的超微結構及緊密連接的寬度，結果顯示，I/R 后1、12 h，I/R大鼠下頜下腺腺泡細胞間的緊密連接結構崩塌，緊密連接寬度降低，而IPC能相對改善緊密連接結構、寬度。提示緊密連接蛋白結構的改變參與了腺體的前期分泌降低，IPC可能通過調控M受體維持緊密連接蛋白固有結構從而起到保護作用，從而改善下頜下腺的分泌功能。

本研究發現，模型組大鼠下頜下腺在保留神經支配的情況下行I/R 1～12 h，腺體的分泌功能較正常側明顯降低，顯微鏡下觀察到腺泡細胞與導管細胞萎縮，間質組織水腫及炎癥反應明顯等組織學改變，這與I/R后腺體的分泌功能變化相符，證實I/R后的損傷—應激反應是移植下頜下腺早期分泌功能損傷低下的重要原因;而觀察組腺體組織損傷明顯減輕，I/R 12 h后下頜下腺的分泌量明顯提高。證明IPC能減輕I/R引起的早期下頜下腺損傷，改善早期移植下頜下腺的分泌功能。

綜上所述，I/R可能導致大鼠下頜下腺M受體表達下降，引起下頜下腺組織損傷，從而影響下頜下腺的分泌功能;而IPC可有效改善上述變化，對下頜下腺I/R損傷具有保護作用。其機制與上調下頜下腺M受體表達、保護下頜下腺緊密連接結構有關。

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Protective effect and mechanism of ischemic preconditioning on rat submandibular gland after ischemia-reperfusion injury

SUN bin1，GAO Jun-tian，SHI Liang，SONG Dai-hui，WEI Feng-cai
(1 School of Stomatology，Shandong University，Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine，Jinan 250012，China)

Abstract:Objective To observe the protective effect of ischemic preconditioning (IPC) on the rat submandibular gland after ischemia-reperfusion (I/R) injury and to investigate the mechanism.Methods Forty-eight healthy male Wistar rats were randomly divided into the observation group and model group，24 in each group.The right glands of rats in both groups received the I/R injury to make the I/R injury models.The glands of the observation group were obtained by 3 min of ischemia，followed by 3 min of reperfusion，and we performed three times before modeling.The left glands were taken as the control group.Salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor levels in 6 rats were detected at different time points (1 h，12 h，24 h and 72 h after I/R).Results In the control group，the salivary secretion，histological changes，alternations of tight junctions (TJs) and mACh-receptor expression levels were all normal.In the model group，the secretion of the glands significantly decreased after I/R 1 h and 12 h，and it showed a slightly lower in the observation group.The secretion of both groups gradually increased at 24 h and got back to normal at 72 h after reperfusion.Cellular atrophy，inflammatory cells infiltration，tissue edema，the collapse and reduced widths of TJs were observed especially after reperfusion for 12 h in the model group，a little part showed the status and the reaction was lighter in the observation group.The level of mACh-receptor exhibited the same tendency，and lower mAChreceptor levels at 12 h after reperfusion were observed in the model group; while in the observation group，it gradually returned to normal.ConclusionIPC has the protective effect on the rat submandibular gland after I/R injury，whose mechanism may be related with the down-regulation of mACh-receptor and protection of TJs.

Key words:ischemic preconditioning; ischemia-reperfusion; submandibular glands; transplantation of submandibular glands; keratoconjunctivitis sicca

(收稿日期:2014-12-04)

通信作者:宋代輝

基金項目:山東省自然科學基金資助項目(ZR2010HM037)。

文章編號:1002-266X(2015)18-0027-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R322.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.009