橙皮苷聯合氟化鈉對體外牛牙釉質礦化的影響

楊文華，孫路全，劉東妮，馬金雙，張向宇(天津市北辰醫院，天津300400;天津醫科大學附屬口腔醫院)

橙皮苷聯合氟化鈉對體外牛牙釉質礦化的影響

楊文華1，孫路全1，劉東妮1，馬金雙1，張向宇2
(1天津市北辰醫院，天津300400;2天津醫科大學附屬口腔醫院)

摘要:目的對牛牙進行體外抑制脫礦和再礦化實驗，探討橙皮苷聯合氟化鈉對牙釉質礦化的影響。方法用48顆新鮮牛牙制備牙釉質切片，隨機分為四組，分別采用氟化鈉(陽性對照組)、去離子水(陰性對照組)、橙皮苷(實驗1組)、橙皮苷聯合氟化鈉(實驗2組)進行體外抑制脫礦和再礦化實驗。測定各組藥物處理釉質切片后鈣離子和磷離子的流出量、再礦化實驗中釉質表面顯微硬度，利用X線能譜儀分析釉質標本表面鈣、磷原子含量并計算鈣原子/磷原子。結果實驗1組鈣離子和磷離子的流出量、釉質表面顯微硬度與陽性對照組比較差異有統計學意義(P均＜0.05)，與陰性對照組比較差異無統計學意義;實驗2組鈣離子和磷離子的流出量、釉質表面顯微硬度與陽性對照組比較差異無統計學意義，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P均＜0.05)。結論在體外條件下，氟化鈉可抑制牛牙釉質脫礦促進再礦化，橙皮苷對牛牙釉質無明顯直接抑制脫礦和促進再礦化作用，與氟化鈉聯用無明顯協同作用，但橙皮苷可能具有穩定牙釉質晶體結構的作用，有助于牙釉質再礦化。

關鍵詞:橙皮苷;氟化鈉;再礦化;抑制脫礦;牛牙

橙皮苷是從檸檬中提取的一種黃酮類物質，具有較強的抗炎活性［1］，能抑制細菌、真菌、病毒生長和繁殖［2］。研究發現，橙皮苷具有抗牙齦卟啉單胞菌的作用［3］，對變異鏈球菌乳酸脫氫酶及蔗糖酶有很好的抑制作用，可減少細菌產酸，預防齲齒［4，5］。氟化鈉具有抑制釉質脫礦和促進再礦化的作用［6］。2014年，我們對牛牙進行體外抑制脫礦和再礦化實驗，檢測橙皮苷對牙釉質礦化的影響及其與氟化鈉聯合應用的效果，為天然抗齲藥物的研發提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料選擇同一種類2～3歲牛的新鮮下頜，體視顯微鏡下觀察，取無齲損、氟斑、裂痕牙48顆，去污，分離冠根，用高速切割機沿正中矢狀長軸將每個切牙冠切成6 mm×6 mm×2 mm的釉質切片，丙烯酸樹脂包埋后暴露唇面釉質，留出5 mm×5 mm釉質面，拋光，超聲清洗，自然干燥。

1.2牙釉質鈣、磷離子濃度檢測

1.2.1抑制脫礦實驗取24顆牛牙的釉質切片，隨機分為陰性對照組(加入去離子水)、陽性對照組(加入氟化鈉1 mg/mL)［10］、實驗1組(加入橙皮苷5 mg/mL)、實驗2組(加入橙皮苷5 mg/mL+氟化鈉1 mg/mL)［11］各6片，分別加入相應藥物30 mL后，以100 r/min勻速攪拌15 min，棄處理液，用去離子水沖洗，加入脫礦液(50 mmol/L乙酸、1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀，用氫氧化鉀將pH調至5.0) 30 mL，37℃水浴100 r/min勻速攪拌30 min，取酸蝕后的脫礦液，用全自動生化分析儀測定鈣、磷離子濃度。

1.2.2再礦化實驗取24顆牛牙的釉質切片，浸入30 mL脫礦液中，37℃處理96 h。將脫礦后的切片按照1.2中的分組方法隨機分為四組，再次浸入脫礦液中反應14 h，分別加入對應藥物反應2 h，再礦化液［1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀、130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，用氫氧化鉀調pH至7.0］反應8 h。每兩個步驟之間使用緩沖液(130 mmol/L氯化鉀、20 mmol/L HEPES，用氫氧化鉀調pH至7.0)沖洗5 min，連續循環8 d。收集循環中的脫礦液，用全自動生化分析儀測定鈣、磷離子濃度。

1.3觀察指標的測算①鈣、磷離子流出量(ESR) : ESR=(未使用實驗藥物處理釉質切片前各組脫礦液中離子濃度－實驗藥物處理釉質切片后各組脫礦液中離子濃度)/未使用實驗藥物處理釉質切片前各組脫礦液中離子濃度。②釉質表面顯微硬度(SMH)及SMH恢復率(EMHR) :脫礦處理前、脫礦后及再礦化實驗后，將標本置于顯微硬度計(努氏壓頭，9.8 N，20 s)下，在每個標本釉質表面中央垂直測5個點，讀取SMH值，根據SMH計算EMHR，EMHR=(再礦化實驗后的SMH－脫礦后的SMH)/(脫礦前的SMH－脫礦后的SMH)。③鈣磷原子比值:使用X射線能譜儀，采用質譜分析法檢測再礦化實驗后各組牙釉質表面鈣、磷原子含量，并計算鈣原子/磷原子。

1.4統計學方法采用SPSS19.0統計軟件，計量資料采用珋x±s表示，對符合正態分布的計量資料和不符合正態分布的計量資料通過Box-cox轉換后進行單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較。α=0.05。

2　結果

2.1抑制脫礦后及再礦化后各組鈣、磷ESR抑制脫礦后及再礦化后，實驗1組鈣、磷ESR顯著高于陽性對照組(P＜0.05)，與陰性對照組比較差異無統計學意義;實驗2組鈣、磷ESR顯著低于陰性對照組(P＜0.05)，與陽性對照組比較差異無統計學意義。見表1。

表1　抑制脫礦實驗及再礦化實驗后各組鈣、磷ESR比較(n=6，mmol/L，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別　鈣ESR抑制脫礦后　再礦化后磷ESR抑制脫礦后　再礦化后陰性對照組4.54±0.40　0.90±0.15　2.39±0.27　1.32±0.05陽性對照組　2.32±0.21*0.48±0.04*　1.31±0.09*0.54±0.03*實驗1組　4.67±0.33#0.81±0.08#　2.38±0.18#1.23±0.17#實驗2組　2.18±0.22*0.47±0.07*　1.24±0.09*0.47±0.05*

2.2再礦化后各組釉質SMH及EMHR實驗1 組EMHR顯著低于陽性對照組(P＜0.05)，實驗2組EMHR顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。見表2。

表2　再礦化后各組釉質SMH及EMHR比較(n=6，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別SMH(kg/mm2)脫礦前　脫礦后　再礦化后EMHR(%)陰性對照組　410.96±7.18　317.26±6.16　320.73±7.33#3.91±10.66陽性對照組　413.80±8.06　321.10±5.89　369.07±9.48*51.48±10.76*實驗1組　409.71±7.91　320.63±6.32　335.45±9.03#15.90±12.11實驗2組　409.94±7.82　319.00±5.76　377.01±8.88*63.82±11.74*

2.3再礦化后各組釉質表面鈣、磷原子及鈣原子/磷原子實驗1、2組與陰性對照組比較均有統計學差異(P均＜0.05)，與陽性對照組比較無統計學差異。見表3。

表3　再礦化實驗各組釉質表面鈣、磷原子含量及鈣原子/磷原子(n=6，±s)

注:與陰性對照組比較，*P＜0.05;與陽性對照組比較，#P＜0.05。

組別　鈣原子(%)　磷原子(%)　鈣原子/磷原子陰性對照組　16.50±3.98#12.51±1.74#　1.30±0.14#陽性對照組　23.24±2.45*14.04±0.91*　1.65±0.09*實驗1組　18.48±1.76*12.48±1.54*　1.49±0.17*實驗2組　18.09±1.23*11.57±0.63*　1.57±0.19*

3　討論

齲病是在致齲菌感染的基礎上，發生牙體硬組織的無機成分脫礦、有機成分溶解等一系列組織學改變的慢性感染性疾病［7］。研究發現，患齲牙齒在唾液中維持著脫礦—再礦化的生物循環過程，對齲病治療應著重于抑制牙體表面脫礦和降低致齲菌酶活性方面。再礦化是在已經脫礦的牙齒硬組織內發生礦物質的重新沉積并進行結晶化。研究證實，早期齲損中，氟可以吸附或結合于脫礦釉質表面，促進鈣、磷的吸收沉積，促使晶體生長［8］。近年來，天然產物因其來源豐富、取材方便、療效顯著、不良反應小等優點成為防齲研究的熱點。橙皮苷是檸檬提取物的主要成分之一，是一種藥理活性確切、應用廣泛的黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、抗氧化［9］等藥理活性。研究證實，檸檬提取物能抑制常見口腔致齲菌的生長［10］，抑制變形鏈球菌在硬組織表面生長黏附［11，12］，對變形鏈球菌和絨毛鏈球菌的葡糖基轉移酶和乳酸脫氫酶有抑制作用［13，14］。

本研究顯示，抑制脫礦實驗中，橙皮苷無明顯抑制釉質溶解度的作用，其與氟化鈉聯合應用與單獨使用氟化鈉對釉質溶解度的抑制作用無明顯差異，提示橙皮苷沒有抑制釉質溶解的作用;再礦化實驗中，實驗1組與陰性對照組對釉質表面顯微硬度的作用無明顯差異，與陽性對照組、實驗2組有顯著差異，說明橙皮苷無明顯促進脫礦釉質再礦化的作用，與氟化鈉聯合應用不增強且不影響氟化鈉促進釉質再礦化的作用。Islam等［3］報道，橙皮苷可以抑制膠原酶活性，保存牛牙牙本質膠原，可能促進再礦化過程。本研究結果與其不同，可能與我們采用的牛切牙釉質中無機物和有機物成分含量以及橙皮苷濃度不同有關。X線能譜分析各組藥物處理后牙釉質表面鈣原子/磷原子結果顯示，實驗1組、實驗2組與陰性對照組比較差異有統計學意義，與陽性對照組比較差異有統計學無意義，實驗1組鈣原子/磷原子增高，提示橙皮苷可能具有穩定牙釉質表面晶體結構作用，有助有牙釉質再礦化，其具體作用機制需進一步研究。

本研究采用質譜分析法分析再礦化實驗后的各組樣本表面成分及含量。質譜分析操作簡便、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快，可以快速準確地反映各組標本中磷離子含量。實驗結果表明，橙皮苷與氟化鈉聯合使用沒有明顯增強氟化鈉促進牛牙釉質再礦化的作用，對抑制釉質脫礦和再礦化也無明顯抑制作用，但橙皮苷可能具有穩定牙釉質表面晶體結構的作用。下一步我們將對橙皮苷治療齲病的濃度進行觀察。

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·臨床研究·

(收稿日期:2014-10-25)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0038-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R780.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.013