氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型的建立

王健，魏丹，謝肄聰(天津醫科大學，天津30005;天津醫科大學總醫院)

氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型的建立

王健1，魏丹1，謝肄聰2
(1天津醫科大學，天津300052;2天津醫科大學總醫院)

摘要:目的采用大黃瀉下法復合改良線栓法建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。方法50只雄性SD大鼠，隨機分為A組(10只)、B組(10只)、C組(15只)、D組(15只)，A組不做處理，B組、D組提前灌胃大黃7 d，C、D組之后接受大腦中動脈阻塞術，B組僅做頸正中切口后縫合。觀察各組大鼠一般形態、血液流變學變化，流式細胞術檢測外周血內皮祖細胞(EPCs)。結果D組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙眼淺紅、微睜、無神，精神萎靡，自主活動少，對外界刺激反應遲鈍，體質量增長緩慢，舌質由淡紅轉為紫黯。與A、B、C組相比，D組血液流變學指標水平高，EPCs數量少(P均＜0.05)。結論采用大黃瀉下法復合改良線栓法成功建立了氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。

關鍵詞:腦血管疾病;大腦中動脈栓塞;氣虛血瘀證;血液流變學;內皮祖細胞

大鼠大腦中動脈線栓法誘導的大腦中動脈栓塞(MCAO)腦缺血模型［1］是研究局灶性腦缺血及缺血再灌注最常用的造模方法。目前，中醫藥治療腦血管疾病的機制研究多采用和借鑒MCAO模型。然而在中醫理論體系下，疾病的發生發展過程中病與證往往是同時存在的，所以簡單復制疾病動物模型或證候動物模型并不能滿足中醫藥研究對動物模型的需要。本研究采用大黃瀉下法復合改良線栓法模擬腦缺血再灌注損傷，旨在采用中西醫結合理論指導下的病證結合造模法，為臨床中西醫結合研究腦血管疾病的病理機制和機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質量220～260 g，購于北京大學醫學部實驗動物科學部，許可證號: SCXK(京) 2009-0017。

1.2主要試劑與儀器生大黃粉劑(深圳華潤三九醫藥貿易有限公司，批號: 1008172S) ;大鼠淋巴細胞分離液(美國Sigma公司) ; PE標記兔抗鼠CD34(美國Santa Cruz Biotechnology) ; FITC標記兔抗鼠CD133(北京博奧森生物技術有限公司) ; 0.01 mol/L PBS緩沖液、0.5% BSA緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。普利生全自動自清洗血流變儀(北京普利生集團) ; LBY-N6B(德國Hereaus公司) ;流式細胞儀(FACSCalibur型，美國BD公司)。

1.3氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型的構建方法及評價所有大鼠平衡飼養3 d，隨機分為A組(10只)、B組(10只)、C組(15只)、D組(15只)，A組不做處理，B組、D組提前灌胃100%生大黃溶液(80℃水沖泡大黃超微粉后再80℃水浴5 min，自然冷卻后雙層紗布過濾，濃縮至100%，4℃冰箱保存，用時水浴至室溫［2］)，4 g/kg，灌胃7 d。C、D組之后根據參照文獻［1］方法建立MCAO模型，模型成功判定標準參考文獻［1］，評分為2～4分則視為腦缺血再灌注模型構建成功。B組僅做頸正中切口后縫合。參考扈新剛研究方法，觀察大鼠外貌、精神、活動、舌質等判斷其是否出現氣虛血瘀證癥狀。術后24 h大鼠股靜脈剪開取血，枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，檢測各項血液流變學指標;并采用郭新賓等［3］密度梯度離心法分離提取外周血內皮祖細胞(EPCs)，流式細胞儀計數CD34/CD133雙熒光標記陽性細胞。

1.4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

A組大鼠被毛光亮整齊，爪甲顏色如常，雙目鮮紅、有神，活動自如，活潑好動，對外界刺激反應靈敏; B組大鼠被毛黯淡且稍枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙目淺紅、有神，活動自如，自主活動減少，對外界刺激反應靈敏; C組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙目淺紅、無神，自主活動少，對外界刺激反應稍遲鈍; D組大鼠被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，雙眼淺紅、微睜、無神，精神萎靡，自主活動少，對外界刺激反應遲鈍。B、C和D組大鼠體質量增長緩慢，甚至出現負增長。B組大鼠舌質淡紅; C組大鼠造模后舌質由淡紅轉為紫色; D組大鼠在造模后舌質由淡紅轉為黯紫。各組最終均選取10只大鼠。各組大鼠血液流變學變化見表1、2。A、B、C、D組每20萬單位的EPCs數量分別為51.904±4.270、53.523±3.541、42.000±16.610、35.827±4.347，C、D組與A、B組比較，D組與C組比較，P均＜0.05。

表1　各組大鼠血液黏度比較(mPa·s，±s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與C組比較，●P＜0.05。

組別　全血黏度(低切1/s)全血黏度(低切5/s)全血黏度(低切30/s)血漿黏度(高切200/s)全血高切還原黏度　全血高切相對指數A組　22.892±0.517　10.552±0.515　6.313±0.469　4.856±0.448　6.585±0.689　3.202±0.239 B組　23.432±0.713　10.263±0.527　6.014±0.341　4.328±0.381　6.371±0.382　3.127±0.216 C組　27.572±0.969＊▲　11.589±0.445＊▲　7.878±0.268＊▲　5.507±0.206＊▲　7.292±0.185＊▲　3.457±0.061＊▲D組　31.502±0.153＊▲●　13.609±0.315＊▲●　8.902±0.275＊▲●　6.263±0.847＊▲●　8.547±0.876＊▲●　3.983±0.034＊▲●

表2　各組大鼠血液紅細胞聚集性能比較(±s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與C組比較，●P＜0.05。

組別　血沉(mm/h)　血沉方程k值　紅細胞聚集指數(mPa·s)　紅細胞剛性指數　紅細胞壓積(%) A組　2.364±1.531　22.388±3.754　4.103±0.362　4.342±0.386　40.01±0.632 B組　4.333±1.751　28.388±9.186　4.258±0.151　4.106±0.328　45.42±1.960 C組　6.836±0.659＊▲　35.152±5.273＊▲　4.738±0.315＊▲　5.103±0.251＊▲　50.67±1.03＊▲D組　7.010±1.265＊▲●　37.482±6.288＊▲●　4.891±0.185＊▲●　5.983±0.964＊▲●　52.31±3.276＊▲●

3　討論

急性腦血管疾病可歸為中醫學的“中風”范疇。缺血性腦血管病中醫臨床分為肝陽暴亢、風痰阻絡、痰熱腑實、陰虛風動及氣虛血瘀5類證型，其中又以氣虛血瘀證所占比例最高［4］，因此本實驗選擇建立該證型腦缺血相關模型。多因素復合模型基于中醫藥理論，結合現代醫學理論與實驗動物科學知識，分別或同時采用中醫學病因復制證候模型和現代醫學病因復制疾病動物模型，使模型動物同時表現出疾病和證候的特征［5］。病證結合動物模型是指在傳統中醫理論的指導下，運用六淫、飲食、情志、勞倦等中醫特有的致病因素建立中醫病因證候模型，在此基礎上通過藥物或手術等方法，建立西醫疾病的模型［6］，制造出既符合西醫疾病的特點又具有相應的中醫癥候特征的復合型動物模型。病證結合動物模型更好地體現了疾病的特點，能夠更好地了解疾病的發展規律，從而更好地為中醫臨床實踐提供服務［7］。

本研究采用復合造模思路，選擇經典的大鼠大腦中動脈線栓法建立MCAO腦缺血模型，大黃瀉下法造成氣虛血瘀證候，復合這兩種方法建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。該模型的評價指標由3方面組成:①根據參考文獻的研究方法觀察大鼠外貌、精神、活動、舌質等變化。研究［8］表明，氣虛血瘀證大鼠會有精神萎靡，雙眼淺紅、微睜、無神，自主活動少，對外界刺激反應遲鈍，被毛黯淡枯燥雜亂，爪甲顏色淺淡，舌質由淡紅轉為黯紫等證候。本研究中D組出現氣虛血瘀證候，且比B組及C組嚴重。②在1986年第2屆全國活血化瘀研究學術會議上，血液流變學指標變化正式被列為診斷血瘀證標準之一。有研究［9，10］報道，氣虛血瘀證大鼠的全血黏度、血漿黏度、血沉、血沉方程k值、紅細胞壓積、紅細胞聚集指數均顯著增高。楊海燕等［11］研究發現，缺血性中風氣虛血瘀型患者的全血黏度、全血還原黏度(低、高)、血漿黏度、紅細胞聚集指數、纖維蛋白原較健康人高。本實驗D組血液流變學指標較A組及C組增大，該結果與其他研究一致。③EPCs參與受損血管內膜的再內皮化，在維持內皮穩態方面發揮重要作用［12］; EPCs還可用于預測腦卒中后神經功能損傷程度、預后及腦血管疾病的治療［13～15］;可作為判定腦損傷的標準之一。本實驗氣虛血瘀證大鼠模型EPCs數量比正常大鼠少。且D組大鼠外周血EPCs數量較A組及C組減少，說明大鼠腦損傷程度嚴重。

本研究在使大鼠形成氣虛血瘀證的基礎上，再進行缺血再灌注處理，以達到中醫病證結合動物模型的要求，使模型鼠的發病過程更接近臨床的病理過程。這不僅保證了模型病、證的準確性，同時較單純中醫證型造模方法的造模時間短，可靠性及穩定性好，為進一步的實驗研究奠定了良好的模型基礎。

參考文獻:

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1) :84-91.

［2］竇倩，謝肄聰.三種不同劑型大黃對大鼠瀉下作用的影響［J］.天津中醫藥，2011，28(6) : 510-512.

通信作者:謝肄聰

基金項目:天津市衛生局中醫中西醫結合科研項目(11106)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0025-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R743

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.008