1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學鑒定

王靜，韓麗，遲曉云，馮智慧(青島思達中獅國際心肺血管醫院，山東青島6607;青島市中心血站)

1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學鑒定

王靜1，韓麗2，遲曉云2，馮智慧2
(1青島思達中獅國際心肺血管醫院，山東青島266071;2青島市中心血站)

摘要:目的對1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學進行鑒定，確定其ABO血型的等位基因型。方法1例ABO血型正反定型不符患者，對其血液樣本進行血型血清學檢測、ABO基因分型檢測、ABO基因Exon6、7序列分析。結果該樣本血清學結果正反定型結果不符，正定型抗A弱凝集，反定型檢出不規則抗-A，血清學符合A亞型的表現。ABO基因分型檢測的結果顯示為O1/A。Exon6、7外顯子及第6內含子序列單倍型測序與A101相比，其中一個等位基因為O102(261G/del、297A＞G、646T＞A、681G＞A、771C＞T、829G＞A) ;另外一個等位基因為A205(467C＞T、1009A＞G)，導致P156L、R337G。結論本例ABO血型基因Exon7的兩個點突變導致了A氨基轉移酶的活性降低，為A205亞型。

關鍵詞:血型; A亞型;基因突變;基因測序

人類血型系統有35種，但ABO血型系統仍是最具臨床意義的血型系統。目前，ABO變異型(亞型)的等位基因報道較多［1，2］。在ABO基因庫中，ABO亞型基因已超過300余種，其中A亞型超過140種，中國人群的A亞型也陸續有報道［3，4］。本研究對1例ABO血型正反定型不符患者血型分子生物學進行鑒定，確定其ABO血型的等位基因型。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料患者女，26歲，因胸悶就診于青島市某心肺血管醫院，醫院檢測ABO血型正反定型不符，2014年10月29日將患者一份血液樣本(EDTANa2抗凝)送至青島市中心血站中心血型參比實驗室進行檢測。該患者無輸血史，無懷孕流產史，未患重大疾病或接受過手術，近期無感染史。

1.2試劑及主要儀器單克隆抗-A、單克隆抗-B、抗-AB、抗A1(Sanquin公司) ;試劑ABO紅細胞、抗-H、A2細胞(上海生物制品有限公司) ;人源抗-A、抗-B(中國醫學科學院輸血研究所) ;抗-D試劑(Millipore公司) ;基因組DNA提取試劑盒(Invitrogen公司) ; ABO基因分型初篩試劑盒(ReadyGene公司) ; Ex-Taq試劑盒、LA-Taq試劑盒(TaKaRa公司)。所有試劑均在有效期內使用。

1.3血型血清學檢測患者全血標本離心取50 μL壓積紅細胞三洗，試管法正反定型。懷疑A亞型后加做人源-A、人源-B、-A1、A2c和-H，應用篩選細胞和一組試劑譜細胞進行抗體篩選和抗體鑒定，明確或排除不規則抗體的存在。

1.4ABO基因分型檢測提取標本基因組DNA，采用Invitrogen DNA提取試劑盒提取。DNA定量分析檢測DNA濃度，純度A260/A280比率在1.6～1.9。按照ReadyGene ABO血型基因檢測試劑盒操作說明進行PCR擴增，擴增后產物通過2%瓊脂糖凝胺電泳，以150 V電泳12 min凝膠紫外成像，并且分析ABO血型SSP基因分型結果。

1.5ABO基因Exon6、7序列分析引物設計參照Olsson等［5］的報道，對Exon6和Exon7進行雙向擴增。PCR擴增反應程序如下: 95℃預變性10 min; 94℃、60 s，63℃、90 s，72℃、60 s，10個循環; 94℃、60 s，61℃、90 s，72℃、60 s，25個循環; 72℃延伸10 min，10℃保溫。擴增產物切膠純化，正反雙向測序。在ABI3100-Avant上進行測序分析。對其PCR產物經割膠純化后，克隆入T載體后將PCR產物轉入大腸桿菌，挑選6～10個陽性克隆進行測序，確定樣本的單倍型。序列分析采用Gentle軟件進行分析。

2　結果

2.1血清學結果紅細胞檢測出弱A抗原，血清中存在弱抗A抗體，血清學表現為Ax型，不規則抗體檢測陰性。正定型中標本-A+，人源-A++，與-A1、-B、人源-B無反應。反定型中A1c+，Bc+++，與A2c、Oc、自身c無反應。抗-H中Pc++++，Ac++，Oc++++。紅細胞A抗原較弱，且不與-A1抗體反應，H抗原表現較強，與O型紅細胞H抗原相當;血清反定型中有弱的-A1抗體(+)。

2.2基因分型結果標本基因初步分型結果為O1/A，見圖1。

2.3ABO基因Exon6、7序列分析結果經過分析發現，Exon6雜合位點為261G/del、297A/G。Exon7 為467C/T、646A/T、681A/G、771C/T、829A/G、1009A/G。見圖2。經過克隆測序，與參比序列A101比較確定標本的基因型為A205/O102(表1)。

3　討論

目前已發現約341種ABO等位基因。ABO亞型的形成具有不同的分子機制，主要為堿基缺失、插入、替代、拼接點突變、等位基因雜交等。A型主要的兩種亞型為A1和A2，兩種亞型占A型的99.9%。A2是A亞型比較常見的一種亞型，約占A型的20%，其血清學的特點表現為正定-A與試劑單克隆-A反應呈弱凝集，與人源多克隆-A反應稍強，與試劑單克隆-A1不反應;反定血清中可檢出抗A1抗體，與A2c不反應;在血型反定型的檢測中1%～8%的A2個體和25%的A2B個體血清中產生同種抗A1抗體。有學者使用單克隆抗體的流式細胞檢測，估計了A1與A2紅細胞上抗原位點的數量分別是8×105～12×105與1×105～4×105。目前國際上報道的A2等位基因有A201～A221，共22種。A205等位基因是日本學者Ogasawara等首次報道，國內學者也發現多種A2亞型［6，7］，且中國人群中A2亞型的分子結構以A205占優勢［8］，大多數A2等位基因先證者為亞洲人群［9，10］。上海血液中心數據顯示中國人群中A201等位基因占A2亞型的20%［11］。有報道高加索人群中幾乎所有A2亞型的遺傳基因為A201。我們發現的A205亞型與Gen-Bank公布的基因序列一致，標本基因含467C＞T、1009A＞G兩個突變。堿基的替換使得部分氨基酸也發生了變化，導致位156氨基酸由脯氨酸(Pro)變為亮氨酸(Leu)，337位氨基酸由精氨酸(Arg)轉變為甘氨酸(Gly)。這兩個氨基酸的改變決定了A2糖基轉移酶的活性，使A2糖基轉移酶的催化活性大為降低。此標本另外一條等位基因為O102等位基因，其與O101等位基因在Exon6第261位胞嘧啶缺失，造成了O基因在261位后發生閱讀框的移動，形成終止密碼子，提前終止了轉移酶的翻譯，使其編碼出來的蛋白只有115個氨基酸，沒有轉移酶的催化功能區。

本實驗室曾經對血清學結果極像Bx亞型的標本進行分子生物學檢測(血型基因直接測序和單倍型測序)，最終定型為Bw03型。提示血清學亞型的結果并不可靠。目前已發現341種ABO等位基因，但是血清學表型卻沒有這么多，說明一種血清學表型對應數種ABO等位基因。鑒于目前我國對血清學亞型報告較多，且常常缺乏核堿基或氨基酸改變的實驗數據，建議對血清學反應特殊標本例如抗原減弱或正反定型不符的標本，不要只根據血清學檢測的經驗報告為ABO亞型，應采用分子生物學方法進行鑒定。目前，核苷酸序列測定是發現新等位基因的惟一方法。另外，建議將血清學反應格局特殊的標本送能夠進行分子生物學鑒定的血型參比實驗室確認，避免誤報。青島市中心血站輸血研究所是我省較早開展ABO亞型基因測序的實驗室，具有一定經驗。

目前國內對ABO亞型個體的輸血原則尚缺乏明確的描述，由于A2亞型紅細胞上A抗原數量較少，在血型鑒定時如果將無償獻血者A2亞型誤判為O型輸注給O型受血者，則會導致溶血性輸血反應。在37℃有反應的抗-A抗體，應考慮其是否具有臨床意義，在配血時應加以考慮。但基本遵循同型或相容性輸注原則。對于本例A205亞型的個體作為受血者手術備血，不應輸入A型血液制品，此例標本血漿中檢出同種抗A1抗體，會與供者紅細胞上的A1抗原發生免疫反應。從現有的血清學特性和分子機制來看，應輸注O型洗滌紅細胞，以確保輸血安全。另一方面，由于A2抗原與A1抗原不僅存在量的差異還存在質的區別，使得A2抗原的抗原性較弱。因此臨床醫生將A2亞型器官捐獻者的心臟、腎臟、肝臟等捐給B型或者O型的器官受體，可使受者器官的生存期明顯延長［12，13］。

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(收稿日期:2015-03-17)

通信作者:馮智慧

基金項目:青島市市南區科技發展資金項目(2013-13-013-YY)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0051-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R457.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.018