膠質瘤組織中miR-200b與CD133的表達變化及意義

劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范(廣東藥學院附屬第一醫院臨床醫學院，廣州510008)

膠質瘤組織中miR-200b與CD133的表達變化及意義

劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范
(廣東藥學院附屬第一醫院臨床醫學院，廣州510008)

摘要:目的觀察膠質瘤組織中miR-200b和CD(133)的表達變化，并探討其意義。方法將80例膠質瘤患者作為試驗組、另選擇20例接受開顱手術的腦外傷或腦出血患者為對照組。采用原位雜交和免疫組化技術檢測試驗組膠質瘤組織及對照組正常大腦組織中的miR-200b與CD(133)，分析膠質瘤組織中miR-200b與CD(133)的相關性及其與患者臨床病理參數的關系。結果試驗組miR-200b陽性表達率(32.65%，32/80)與對照組(80.00%，16/20)比較，P=0.001。試驗組CD(133)陽性表達率(67.50%，54/80)與對照組(15.00%，3/20)比較，P=0.000。試驗組miR-200b與CD(133)的表達呈負相關(r=－0.09，P=0.006)。試驗組miR-200b和CD(133)表達與患者病理分期有關(P均＜0.05)，與性別、年齡無關。結論膠質瘤組織中miR-200b低表達、CD(133)高表達，兩者均與膠質瘤病理分期有關。

關鍵詞:腦腫瘤;膠質瘤;微小RNA-200b;分化抗原簇蛋白133

微小RNA(miRNAs)是重要的調控因子，能調控細胞的增殖、分裂、分化、凋亡等過程。研究［1～4］表明，miR-200b在腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移過程中發揮重要作用，對多種腫瘤具有抑制作用。CD133是干細胞和腫瘤干細胞表面特異標志蛋白，在白血病和乳腺癌中表達上調［5，6］。研究［7］顯示，miR-200b可通過靶向調控CD133的表達抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲以及干細胞的形成。本研究采用免疫組化和原位雜交技術，分析膠質瘤組織中miR-200b和CD133的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇南華大學第一附屬醫院2010 年3月～2014年2月收治并確診為膠質瘤的80例患者(試驗組)，術前均未行放化療，手術切除腫瘤組織。其中男44例、女36例，年齡7～62歲、中位年齡42歲;根據WHO腫瘤分類標準，Ⅰ級15例、Ⅱ級27例、Ⅲ級30例、Ⅳ級8例。病理診斷結果均由2名以上病理科醫生共同確診。另將20例接受開顱手術的腦外傷或腦出血患者作為對照組，其腦組織經HE染色證實為非腫瘤組織。兩組一般資料具有可比性。

1.2主要試劑原位雜交檢測試劑盒與ElivisionTMPlus二步法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司，地高辛標記的miR-200b探針序列購自美國Exiqon公司，CD133單克隆抗體購自CST公司。

1.3miR-200b與CD133檢測及分析方法①原位雜交檢測膠質瘤組織與正常大腦組織中的miR-200b。切片后脫蠟至水。3%胃蛋白酶消化20～30 min，水洗后4%甲醛固定。按miRNAs原位雜交說明，探針用無酶水稀釋，稀釋比例為1∶500，先用預雜交液于55℃預雜交2 h后再用地高辛標記的miR-200b探針于55℃進行雜交過夜。次日于不同濃度SSC緩沖液中徹底洗滌干凈。室溫封閉30 min。生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h。DAB顯色并于鏡下控制顯色時間，蘇木素復染細胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。②免疫組化檢測膠質瘤組織與正常大腦組織中的CD133。采用ElivisionTMPlus二步法，切片后脫蠟至水。按需要對切片進行高壓修復，冷卻至室溫，PBS液洗凈。每張切片加50 μL一抗體，室溫下孵育4℃過夜，PBS洗凈后每張切片加50 μL生物素標記的二抗體，室溫下孵育10 min。PBS洗凈，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS洗凈后DAB溶液顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木素復染細胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。③免疫組化和原位雜交結果分析。miR-200b 與CD133呈棕黃色顆粒的陽性信號定位于膠質細胞與膠質瘤細胞的細胞質與細胞核中。綜合陽性信號的染色強度和分布范圍進行半定量，陽性強弱按以下標準判斷［1］。每個標本于高倍光鏡下觀察5個具有代表性的視野，對陽性染色的細胞比例和染色程度進行統計。組織細胞陽性染色程度計分:陰性計1分;+ 計2分;++計3分;+++計4分;組織細胞陽性細胞分布比例計分:染色細胞小于10%計1分;染色細胞10%～50%計2分;染色細胞51%～75%計3分;染色細胞大于75%計4分。兩種得分相乘，＜8為低表達，≥8為高表達。顯微攝像后運用病理圖像分析系統對光密度值進行檢測，結果進行統計分析。

1.4統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗;計數資料比較用χ2檢驗，相關性分析用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

試驗組miR-200b陽性表達率(32.65%，32/80)與對照組(80.00%，16/20)比較，χ2=10.26，P=0.001。試驗組CD133陽性表達率(67.50%，54/80)與對照組(15.00%，3/20)比較，χ2=17.99，P=0.000。試驗組miR-200b與CD133的表達呈負相關(r=－0.09，P=0.006)。試驗組miR-200b與CD133的表達與臨床病理參數的關系見表1。miR-200b和CD133表達與與患者病理分期有關(P均＜0.05)，與性別、年齡無關。

3　討論

miRNAs通過調控其靶基因影響一系列mRNAs的表達，從而在生理和病理學過程中發揮重要作用。越來越多的研究［8］表明，大量的miRNAs在腫瘤的發生與發展過程(細胞的增殖、干細胞自我更新以及分化)中發揮癌基因或抑癌基因作用。大量miRNAs的異常表達與膠質瘤發生發展有關，如miR-34a［9］、miR-203［10］、miR-22［11］在膠質瘤中表達下調; miR-372［12］、miR-17［13］、miR-221/222［14］在膠質瘤中表達上調，為膠質瘤患者不良預后的重要標志物。由此可見，具有癌基因或抑癌基因樣作用的miRNAs可能與人類膠質瘤的發生密切相關。最近的研究發現，miRNAs的表達與多形性膠質瘤母細胞瘤(GBM)患者的總生存期和疾病進展的時間相關。Srinivasan等［15］分析了222例同時進行了放化療再輔以TMZ治療的GBM患者的10個miRNA，發現miR-20a、miR-106a和miR-17-5p在長期存活的患者中高表達，而miR-221/222、miR-148a、miR-31、miR-146b和miR-193a在短期存活的患者中高表達。一些miRNAs如miR-181c、miR-21、miR-221/222、miR-195、miR-146a與膠質瘤細胞放化療抵抗相關，表明這些miRNAs具有預測特性。

miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，其中miR-200b-200a-429簇位于1p36染色體，而miR-200c-141簇位于12p13染色體［16］。在功能上，miR-200家庭成員可以調控一系列轉錄因子，包括Zeb1、Ets-1、Suz12［17］。在膠質瘤中，miR-200b通過靶向CREB1抑制膠質瘤細胞的增殖［18］。Tang等［1］研究顯示，miR-200b在胃癌組織中表達下調，并且其表達狀態與胃癌患者的臨床分期、淋巴結轉移以及預后生存相關。然而Cao等［19］顯示，miR-200b在卵巢癌中表達上調，并且與患者的臨床分期、組織分化程度以及預后生存相關。CD133是一種常見的腫瘤干細胞標志物，最初在造血干細胞中被發現。CD133在多種實體腫瘤中高表達，如乳腺癌［6］、結腸癌［20］、肺癌［21］，并可作為腫瘤患者預后的生物標志物。本研究結果表明，膠質瘤組織中miR-200b低表達、CD133高表達，miR-200b的陽性表達率隨著膠質瘤惡性程度的增加而降低、CD133的陽性表達率隨著膠質瘤惡性程度的增加而增高。可見，膠質瘤組織中miR-200b與CD133的表達與患者病情程度有關。

參考文獻:

［1］Tang H，Deng M，Tang Y，et al.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression ［J］.Clin Cancer Res，2013，19(20) : 5602-5612.

［2］Manavalan TT，Teng Y，Litchfield LM，et al.Reduced expression of miR-200 family members contributes to antiestrogen resistance in LY2 human breast cancer cells［J］.PLoS One，2013，8 (4) : e62334.

［3］Toiyama Y，Hur K，Tanaka K，et al.Serum miR-200c is a novel prognostic and metastasis-predictive biomarker in patients with colorectal cancer［J］.Ann Surg，2014，259(4) : 735-743.

［4］Xu S，Xu P，Wu W，et al.The biphasic expression pattern of miR-200a and E-cadherin in epithelial ovarian cancer and its correlation with clinicopathological features［J］.Curr Pharm Des，2014，20(11) : 1888-1895.

［5］周余，孟恒星，于珍，等.CD133在急性白血病中的表達及其意義［J］.中華血液學雜志，2004，25(7) : 401-404

［6］Han Z，Chen Z，Zheng R，et al.Clinicopathological significance of CD133and CD44 expression in infiltrating ductal carcinoma and their relationship to angiogenesis［J］.World J Surg Oncol，2015，13(1) : 486.

［7］趙文健，楊亮，何漢江.miR-200b通過靶向CD133抑制膠質瘤細胞和膠質瘤干細胞的生長［J］.腫瘤，2014，34(3) : 231-237.

［8］Ling H，Zhang W，Calin GA.Principles of microRNA involvement in human cancers［J］.Chin J Cancer，2011，30(11) : 739-748.

［9］Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis［J］.J Neurooncol，2013，113(2) : 221-228.

［10］He J，Deng Y，Yang G，et al.MicroRNA-203 down-regulation is associated with unfavorable prognosis in human glioma［J］.J Surg Oncol，2013，108(2) : 121-125.

［11］李榮國，王劍，楊少陵.miR-22通過靶向MTDH抑制膠質瘤細胞的生長［J］.中國癌癥雜志，2014，24(6) : 401-405.

［12］Li G，Zhang Z，Tu Y，et al.Correlation of microRNA-372 upregulation with poor prognosis in human glioma［J］.Diagn Pathol，2013，(8) : 1.

［13］Lu S，Wang S，Geng S，et al.Increased expression of microRNA-17 predicts poor prognosis in human glioma［J］.J Biomed Biotechnol，2012，(2012) : 970761.

［14］Zhang C，Zhang J，Hao J，et al.High level of miR-221/222 confers increased cell invasion and poor prognosis in glioma［J］.J Transl Med，2012，(10) : 119.

［15］Srinivasan S，Patric IRP，Somasundaram K.A ten-microRNA expression signature predicts survival in glioblastoma［J］.PloS One，2011，6(3) : e17438.

［16］Park SM，Gaur AB，Lengyel E，et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2［J］.Genes Dev，2008，22 (7) : 894-907.

［17］Gregory PA，Bert AG，Paterson EL，et al.The miR-200 family and miR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1［J］.Nat Cell Biol，2008，10(5) : 593-601.

［18］Peng B，Hu S，Jun Q，et al.MicroRNA-200b targets CREB1 and suppresses cell growth in human malignant glioma［J］.Mol Cell Biochem，2013，379(1-2) : 51-58.

［19］Cao Q，Lu K，Dai S，et al.Clinicopathological and prognostic implications of the miR-200 family in patients with epithelialovarian cancer［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(5) : 2392-2401.

［20］Horst D，Kriegl L，Engel J，et al.CD133expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2008，99(8) : 1285-1289.

［21］Wu S，Yu L，Wang D，et al.Aberrant expression of CD133in nonsmall cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry ［J］.BMC Cancer，2012，(12) : 535.

(收稿日期:2015-01-29)

通信作者:洪銘范

基金項目:廣東省醫學科研基金立項課題(A2013321) ;省企業技術研發與升級改造專項基金項目(B2013B0218011251)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0053-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.019