宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞計數(shù)變化及意義

單莉，郝春妮(煙臺山醫(yī)院，山東煙臺264001)

宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞計數(shù)變化及意義

單莉，郝春妮
(煙臺山醫(yī)院，山東煙臺264001)

摘要:目的觀察宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的表達變化，并探討其意義。方法108例宮頸鱗狀細胞癌患者，手術(shù)切除腫瘤組織，免疫組化學染色觀察宮頸鱗狀細胞癌組織中、Foxp3+、GranzymeB+、細胞的分布，同時對其進行計數(shù)。分析其與患者臨床病理參數(shù)和預后的關(guān)系。結(jié)果宮頸鱗狀細胞癌患者Foxp3+細胞數(shù)量癌內(nèi)大于癌周、細胞數(shù)量癌周大于癌內(nèi)(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數(shù)量與臨床分期有關(guān)，F(xiàn)oxp3+細胞數(shù)量與病理分級有關(guān)和Foxp3+細胞數(shù)量與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細胞癌組織Foxp3+細胞與患者無瘤生存時間呈負相關(guān)(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與總生存時間呈負相關(guān)(HR: 2.451，95% CI: 1.992 ～2.734，P=0.033)。結(jié)論宮頸鱗狀細胞癌組織內(nèi)、細胞數(shù)量增多，F(xiàn)oxp3+細胞數(shù)量減少。Foxp3+細胞是宮頸鱗狀細胞癌術(shù)后的獨立預后因素。

關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;宮頸鱗狀細胞癌;免疫微環(huán)境;免疫逃逸;腫瘤浸潤淋巴細胞

宮頸鱗狀細胞癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康和生命。關(guān)于宮頸鱗狀細胞癌的預后因素研究一直聚焦于腫瘤細胞本身，較少研究與腫瘤局部免疫微環(huán)境指標的關(guān)系。腫瘤浸潤淋巴細胞是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)以T細胞為主的一種異質(zhì)性淋巴細胞群體，是機體淋巴細胞浸入到腫瘤組織內(nèi)部對腫瘤的抵抗現(xiàn)象，它們的抗腫瘤免疫效應主要是細胞免疫反應［1，2］。本研究主要的腫瘤浸潤淋巴細胞的亞型有、Foxp3+細胞，暫未列入細胞［3，4］。本研究觀察了宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月～2014年12月在煙臺山醫(yī)院住院手術(shù)的宮頸鱗狀細胞癌患者108例，年齡35～72(45.3±9.6)歲，均有完整的臨床病理資料。依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，2000年)修訂的臨床分期標準，Ⅰ期42例、Ⅱ期31例、Ⅲ期35 例;病理分級: G1級30例、G2級43例、G3級35例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。患者均行手術(shù)完整切除腫瘤，組織學檢查切緣陰性。排除標準:曾接受過放化療及免疫治療;合并免疫系統(tǒng)疾病;合并慢性消耗性疾病及傳染病;合并有其他類型惡性腫瘤。

1.2腫瘤浸潤淋巴細胞檢測及其與宮頸鱗狀細胞癌患者預后的關(guān)系分析方法采用免疫組化法檢測108例宮頸鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中NK細胞、Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、GranzymeB+活化的細胞毒性淋巴細胞、CD45RO+記憶T細胞、細胞毒T細胞的數(shù)量。用不同的單克隆抗體［鼠抗人CD45RO、鼠抗人CD57、兔抗人CD8、鼠抗人GranzymeB購自Maixin-Bio(邁新生物)，F(xiàn)oxp3+抗體購自BioLegend(USA)］對上述細胞行免疫組化染色。二抗為Leica-二抗套裝試劑。采用Leica公司的全自動免疫組化染色一體機，所有步驟由Bond-Max自動完成。在400倍高倍顯微鏡下觀察陽性細胞(細胞膜或細胞核呈棕色或棕黑色顆粒者判定為陽性細胞)。采用電腦圖像采集系統(tǒng)隨機選取5個高倍視野拍照，再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計算總陽性細胞數(shù)。由2位高年資病理科醫(yī)師讀片，采取雙盲交叉讀片，取平均值。患者臨床病理資料包括年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移情況等。生存期從手術(shù)當天計算，終止日期為死亡日期或末次隨訪日，所有病例截止日期為2014年6月31日。對可疑復發(fā)者進行強化CT和(或) MR掃描來確診復發(fā)/轉(zhuǎn)移。分析上述免疫細胞與患者臨床病理參數(shù)和預后的關(guān)系。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較用t檢驗;計數(shù)資料比較用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;相關(guān)分析采用Spearman相關(guān);累積生存時間和累積生存率計算采用Kaplan-Meier法，生存檢驗采用Log-rank檢驗;用Cox回歸模型作單因素和多因素與預后關(guān)系的分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的分布、數(shù)量除Foxp3+陽性染色細胞為細胞核棕色著色外，其余細胞均呈細胞質(zhì)和(或)細胞膜棕色染色。細胞呈圓形或橢圓形，散在分布于腫瘤細胞和周圍間質(zhì)中，沒有明顯的密集趨勢。GranzymeB+陽性染色呈顆粒狀的細胞質(zhì)著色，細胞無密集趨勢，均散在分布于癌組織、周圍增生的纖維組織中，棕色陽性顆粒可環(huán)繞細胞呈圓形或半圓形。CD45RO+陽性細胞呈細胞質(zhì)或細胞膜棕褐色，細胞體積較小，大部分彌散性分布。細胞為細胞膜和細胞質(zhì)呈棕黃色染色的小圓細胞。宮頸鱗狀細胞癌患者癌內(nèi)、癌旁組織中細胞分別為30.15±細胞分別為340.53±50.11、430.29±38.74，GranzymeB+細胞分別為29.03±1.53、40.37±3.42細胞分別為128.71 ±22.73、240.38±37.97，F(xiàn)oxp3+細胞分別為31.03 ±2.41、19.32±3.56，兩者比較，P均＜0.05。

2.2宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數(shù)量與患者臨床分期有關(guān)(P均＜0.05)，腫瘤臨床分期越高細胞局部浸潤越少。宮頸鱗狀細胞癌組織中Foxp3+和細胞數(shù)量與患者病理分級有關(guān)(P均＜0.05)，腫瘤分化越差患者Foxp3+細胞越多，腫瘤分化越好患者細胞越多。宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數(shù)量與患者淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0.05)，有淋巴轉(zhuǎn)移的患者Foxp3+細胞越多，無淋巴轉(zhuǎn)移的細胞越多。詳見表1。

表1　宮頸鱗狀細胞癌組織中浸潤淋巴細胞數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(個，±s)

臨床病理參數(shù)　n　CD+57　CD45RO+　GranzymeB+　CD+8　Foxp3+年齡≤40歲　35　29.65±2.56　346.78±98.54　28.43±6.21　126.65±23.97　30.23±4.56 ＞40歲　73　30.42±6.16　334.53±65.11　29.85±3.47　130.91±31.17　31.77±7.23臨床分期Ⅰ42　28.32±3.61　394.28±64.14　29.72±5.33　149.83±25.14　28.41±4.34 Ⅱ31　31.77±2.79　336.43±23.77　28.63±2.37　124.74±35.36　30.28±5.16 Ⅲ35　29.32±1.57　287.24±71.35　29.09±3.24　96.23±13.42　30.13±3.75病理分級G1　30　27.57±9.47　380.79±31.11　30.41±2.31　121.37±13.41　36.24±5.6 G2　43　29.91±3.04　326.88±26.12　29.04±4.27　128.43±13.54　30.27±1.02 G3　35　28.97±1.45　286.27±24.41　28.78±3.44　128.17±12.87　25.97±3.47淋巴轉(zhuǎn)移有41　31.22±3.82　328.59±79.31　27.13±1.25　106.43±18.64　39.27±3.86 無67　28.89±2.63　357.64±81.35　29.23±3.51　147.59±18.17　22.23±4.76

2.3宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞與患者預后的關(guān)系108例患者整體的5年無瘤生存率分別為53.70%，總生存率為47.22%。中位隨訪時間為28個月(3～80個月)。主要死于腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移。使用X-tile軟件計算出的最小P值作為cutoff值將各腫瘤浸潤淋巴細胞分成高浸潤組、低浸潤組。CD5+7細胞cut-off值為29.36，高浸潤組45例、低浸潤組63例; CD45RO+細胞cut-off值為310.58，高浸潤組68例、低浸潤組40例; CD8+細胞cut-off值為115.71，高浸潤組60例、低浸潤組48例; GranzymeB+細胞cut-off值為28.47，高浸潤組57例、低浸潤組51例; Foxp3+細胞cut-off值為27.17，高浸潤組49例、低浸潤組59例。COX單因素生存分析顯示，患者無瘤生存時間(DFS)與宮頸鱗狀細胞癌組織CD8+細胞(HR: 0.997，95% CI: 0.684～1.314，P=0.028)呈正相關(guān)、Foxp3+細胞(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)呈負相關(guān);患者總生存時間(OS)與宮頸鱗狀細胞癌組織CD8+細胞(HR: 1.057，95%CI: 0.792～1.372，P=0.046)呈正相關(guān)、Foxp3+細胞(HR: 2.451，95% CI: 1.992～2.734，P=0.033)呈負相關(guān);患者DFS、OS與癌組織CD5+7、CD45RO+、GranzymeB+細胞無關(guān)。COX多因素生存分析顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織Foxp3+細胞與患者DFS呈負相關(guān)(HR: 2.217，95% CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與OS呈負相關(guān)(HR: 2.451，95%CI: 1.992～2.734，P=0.033)。

3　討論

作為腫瘤與機體作用的主要部位，腫瘤局部免疫反應在一定程度上反映了機體抗腫瘤免疫的總體水平。腫瘤局部的免疫以特異性的細胞免疫為主導，其效應細胞為細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞。NK細胞具有無需抗原刺激即能殺傷腫瘤細胞的能力。細胞毒性T淋巴細胞被一致認為是最主要的免疫效應細胞［1，5］。活化的細胞毒性T細胞以GranzymeB+為標志物。抗原特異性記憶T淋巴細胞可以在特定細胞因子的作用下分化為效應T淋巴細胞，也可以像干細胞一樣自我更新、繼續(xù)分化為記憶/效應細胞，因此記憶T細胞可以作為T細胞活化標志［3，4］。Foxp3+Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能。以上細胞均在局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮著免疫監(jiān)視、免疫效應、殺傷腫瘤細胞的作用［6，7］。

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細胞癌周圍的、細胞數(shù)量明顯多于癌內(nèi)部，這表明機體在腫瘤周圍的免疫反應明顯強于腫瘤內(nèi)部。進一步分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細胞癌的臨床分期越晚，細胞局部浸潤越少;腫瘤分化越差，CD45RO+細胞越少，這說明隨著病情進展，腫瘤晚期內(nèi)部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)越來越嚴重。同時，細胞在有淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細胞癌中數(shù)量少于無淋巴轉(zhuǎn)移者，提示腫瘤是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移與局部免疫反應有密切關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細胞癌內(nèi)的Foxp3+細胞浸潤數(shù)量較腫瘤周圍多。說明腫瘤內(nèi)微環(huán)境中，T細胞介導的免疫反應受到了抑制。類似的差異也見于許多實體腫瘤，如胃癌、肺癌等。腫瘤局部Foxp3+Treg細胞數(shù)量反映了在腫瘤內(nèi)部宿主與腫瘤之間的免疫活動。有效的抗腫瘤免疫反應能抑制腫瘤細胞的潛在侵襲性，具有免疫抑制能力的Foxp3+Treg細胞則可能放任腫瘤侵襲［8，9］。這也進一步可以解釋，在較差臨床分期的宮頸鱗狀細胞癌組織中有高浸潤的Foxp3+Treg細胞。可見，宮頸鱗狀細胞癌局部微環(huán)境中免疫抑制與免疫效應作用的力量對比關(guān)系決定了局部的免疫狀態(tài)，并影響甚至決定了腫瘤的進展方向，局部免疫效應作用越強越不利于腫瘤生長侵襲，局部免疫抑制作用越強越有利于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

通過Cox單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細胞癌組織內(nèi)Foxp3+Treg細胞數(shù)量的多少是宮頸鱗狀細胞癌術(shù)后的獨立預后因素。有研究［10］曾報道Foxp3+Treg細胞高浸潤是胃癌的獨立預后因素。可見，Treg對免疫環(huán)境起負性作用，局部高浸潤Treg細胞可能直接導致宮頸鱗狀細胞癌患者有較差的預后。其可能的機制主要是通過各種途徑直接或間接抑制效應性T細胞的增殖，活化及抑制T細胞和NK細胞對腫瘤的殺傷作用［11］;引起DC細胞的凋亡［12］;競爭抑制IL-2［8］等影響效應T細胞對腫瘤的免疫應答。

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(收稿日期:2015-01-21)

文章編號:1002-266X(2015) 19-0061-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.022