飼料及畜產品中激素殘留檢測方法研究進展

趙春娟，高文惠（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊　050000）

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飼料及畜產品中激素殘留檢測方法研究進展

趙春娟，高文惠*
（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊050000）

摘要：隨著養殖業與畜牧業的快速發展，各種激素、飼料添加劑被廣泛使用，而飼料及畜產品中激素殘留會對環境和人體健康產生影響。因此，對飼料及畜產品中激素殘留檢測方法的研究尤為重要。文章綜述了飼料及畜產品中激素殘留檢測技術。

關鍵詞：飼料；畜產品；激素殘留；檢測方法

近幾年，飼料及畜產品中激素殘留污染問題引起世界上的廣泛關注。在動物飼養及其飼料加工過程中濫用激素，最終導致畜產品被激素殘留污染[1]。因此，必須要加強對飼料中違禁類激素的檢測，從源頭上控制激素殘留。研究表明，在一定的飼養條件下，一些激素類藥物在動物喂養期間可以引起蛋白質沉淀，提高飼料轉化利用率，加快動物增重速度，取得更顯著的經濟效益。但殘留于畜產品中的激素類藥物通過食物鏈進入人體，導致人體激素中毒，甚至一些殘留激素存在致癌的潛在危害，嚴重威脅消費者的身體健康[2-3]。我國農業部已于2002年發布176號公告，明確規定禁止在飼料中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，苯丙酸諾龍等雄性激素以及蛋白同化激素。但受經濟利益的驅使，飼料中違規添加激素的事件仍時有出現，因此，檢測飼料及畜產品中激素等添加劑具有重要意義。

常見的激素類物質主要包括甾體激素和非甾體類激素。飼料及畜產品中的激素主要包括β-興奮劑、性激素、動物生長素等。目前，飼料及畜產品中激素殘留檢測方法主要包括高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、高效毛細管電泳法以及免疫分析法等[4-14]。其中免疫分析法根據其標記物的種類又可分為放射免疫分析法、酶聯免疫分析法、熒光免疫分析法、化學發光酶免疫分析法。

1　高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是分析檢測中常用的方法，可以在常溫條件下實現對高沸點、熱穩定性差、摩爾質量大的物質進行檢測。鑒于其高效、高靈敏度的特點在激素殘留檢測領域得到了廣泛的應用，同時為建立液相色譜-質譜聯用法奠定了基礎。劉紅菊等采用固相萃取反相高效液相色譜法對飼料中10種性激素進行測定，樣品經乙腈超聲提取，并選用乙腈-水進行梯度洗脫，試驗結果表明，10種性激素線性關系良好，相關系數均> 0.999 8，加標回收率為95.32%～102.5%，RSD< 1.8%[15]。該方法簡單可靠，樣品的雜質干擾較少，適用于飼料中違禁性激素的殘留分析。李蘭等采用DAD二極管陳列檢測器同時檢測飼料中的5種糖皮質激素，為保證各組分有良好的分離度和合理的分析時間，采用梯度淋洗，5種組分的分離度均>1.5，分峰型尖銳，分析時間28 min，在豬配合飼料中，3個濃度水平的5種糖皮質激素的回收率>66.5%，RSD≤10.6；在雞配合飼料中，3個濃度水平的5種糖皮質激素的回收率>66.4%，RSD≤10.0[16]。盧艷芬等建立高效液相色譜法同時測定飼料中的克倫特羅和萊克多巴胺，建立了酸性甲醇-水混合溶液提取、混合有機溶劑萃取、固相萃取柱凈化、反相色譜柱分離、雙波長紫外檢測器檢測相結合的方法，樣品加標回收率為62%～97%，RSD<10%，該方法與單獨測定兩種β-激動劑相比省時省力，降低檢測成本，實現了兩種物質的同時測定，能夠滿足飼料中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺監控檢測的要求[17]。Fan等通過超高效液相色譜-質譜聯用法（UPLC-MS/MS）測定了10類固醇激素，結果表明，應用此方法，分析物在MS/MS上的響應值和類固醇激素的濃度間有很好的線性關系，其檢測限為0.01 μg·kg-1，雞肉、豬肉、牛肉和香腸樣品中加標回收率是76.8%～98.7%，RSD<10%[18]。該方法具有較高的靈敏度和重復性，并能在成分復雜的食物中迅速檢測出類固醇激素的殘留量。

2　液質聯用法

液質聯用法（LC-MS）是以液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統的一種檢測方法。樣品在質譜中與流動相分離，樣品被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質荷比（m/z）分離，經檢測器得到質譜圖。液質聯用法體現了色譜和質譜的優勢互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與質譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在食品分析、藥物分析、環境分析等領域得到了廣泛的應用。張毅等建立了谷物類飼料中10種雄性激素、11種孕激素、10種糖皮質激素、5種雌性激素以及5種二羥基苯甲酸內酯類藥物的液相色譜-串聯質譜（LC- MS/ MS）檢測方法，均質樣品經乙酸乙酯提取，以改良的QuEChERS吸附劑分散于提取液中實現快速凈化，采用C18色譜柱分離，分別在正、負電噴霧串聯質譜多反應監測模式下檢測，試驗優化了影響QuEChERS凈化效果和LC-MS /MS分析性能的主要因素[19]。所建立方法的前處理過程簡便、凈化效率高，方法的靈敏度、回收率和精密度能較好地滿足禁用激素測定的要求。該方法為谷物類飼料中禁用激素的監控和管理提供了良好的技術支持。張文剛等采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測飼料中6種玉米赤霉醇激素類藥物，試驗中對樣品的前處理和儀器檢測條件進行優化，在0.5～100 μg·kg-1線性良好，檢出限為2 μg·kg-1，標準添加回收率為63.5%～117%，適用于飼料中玉米赤霉醇類藥物的分析檢測[20]。潘云山等用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜檢測飼料中10種β-受體激動劑，樣品經高氯酸提取、HLB柱凈化，C18色譜柱分離，電噴霧（ESI）離子源電離，多反應監測（MRM）對10種受體激動劑進行定性、定量分析，試驗結果顯示，10種目標物質在0.5～40 μg·L-1線性良好，相關系數> 0.999，回收率為71.2%～103%，相對標準偏差3.7%～ 9.8%，方法定量限（S/N=10）為0.01 mg·kg-1[21]。該方法樣品處理簡單，靈敏度高，定性準確，可用于飼料中β-受體激動劑的定性、定量檢測。Kaklama?nos等采用液相色譜-串聯質譜法測定牛血清中12種合成代謝類固醇，蛋白沉淀后，血清樣品經過HLB固相萃取小柱凈化，在正、負兩種大氣壓化學電離模式下，采用多重反應對其進行檢測，試驗結果顯示，檢測限為0.02～0.12 ng·mL-1，回收率為70.2%～118.2%，該方法靈敏、準確、選擇性強，適用于類固醇激素的高通量定量分析[22]。Yang等建立了高效液相色譜-電噴霧串聯質譜檢測豬肝、牛奶、肌肉當中50種蛋白同化激素，目標物經過酶解后用甲醇提取，經石墨碳化氨基柱凈化后上機測定，試驗結果表明，定量限為0.04～2.0 μg·kg-1，平均回收率為76.9%～121.3%，RSD為2.4%～21.2%[23]。

3　氣質聯用法

氣質聯用法（GC-MS）是將氣相色譜儀與質譜儀通過適當接口相結合，借助計算機技術，進行聯用分析的技術。將氣相色譜法的高分離優勢與質譜法的高鑒別能力相結合。氣質聯用法具有靈敏度更高，定性、定量準確等優點，可以在多種殘留物同時存在的情況下對其中的某種特定物質進行定量、定性檢測。但氣質聯用法要求目標物質沸點較低、熱穩定好。李勝等采用氣相色譜-質譜法測定飼料中萊克多巴胺，樣品經N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺衍生，選用選擇監測離子模式進行檢測，試驗結果表明，萊克多巴胺衍生物的峰面積與其濃度為20.0～1 000 μg·L-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數>0.997，樣品加標回收率為67.5%～92.3%，變異系數為3.0%～12%，方法檢出限達5 μg·kg-1[24]。楊柳等建立了氣質聯用法對乳牛飼料中領苯二甲酸酯類環境激素進行測定，樣品經乙腈超聲提取30 min，結果顯示，回收率為85.42%～104.92%，標準偏差為1.12%～4.97%，方法準確可靠；對乳牛飼料樣品中6種鄰苯二甲酸酯類環境激素進行了檢測，其中鄰苯二甲酸正二丁酯（DnBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基）乙酯（DEHP）含量相對較高，青貯飼料中單項和總鄰苯二甲酸酯類環境激素（PAEs）含量高于精飼料[25]。林維宣等建立了動物組織10種β-興奮劑類獸藥殘留量的氣相色譜-質譜法檢測方法，樣品經pH 5.2乙酸鈉溶液提取，提取液依次經乙酸乙酯-異丙醇（60?40）混合溶劑和叔丁基甲醚-異丙醇（5?1）萃取凈化，再經Strata-X-C陽離子交換柱（500 mg, 3 mL）凈化后，用BSTFA?TMCS（99?1）衍生劑衍生，采用HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱進行氣相色譜-質譜法分析，通過對質譜條件的一系列優化，兼顧各成分的靈敏度，建立了最佳質譜分析條件，10種β-興奮劑類獸藥檢出限1～5 μg·kg-1。室內平均回收率為59.1%～77.4%，變異系數（CV%）為0.87～7.04[26]。該方法的檢測限、回收率和精密度等技術指標滿足對β-興奮劑殘留量檢測的有關要求。Zeng等建立了豬肉組織中8種合成代謝類固醇激素的GC-MS多殘留檢測方法，樣品經液液萃取、凈化后，在最佳試驗條件下，8種目標物質在2.5～50 μg·kg-1線性關系良好，回收率為67.7%～ 120%，方法可靠、適用[27]。

4　毛細管電泳技術

毛細管電泳（CE）又稱高效毛細管電泳（HPCE），是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。該技術具有分離效率高、分析速度快、樣品前處理簡單等優點。張敬敬等建立了一種應用毛細管電泳法快速、高效分離畜產品中β-受體激動劑的方法，在最佳試驗條件下，4 min內實現了克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種β-受體激動劑的基線分離。在8～100 μg·mL-1線性關系良好，相關系數>0.997 1，平均回收率為89.20%～95.34%，RSD≤3.33%（n=5），倫特羅和萊克多巴胺的檢測限均為4.5 μg·mL-1，沙丁胺醇的檢測限為5.5 μg·mL-1[28]。段建平等建立了同時測定飼料中西馬特羅、鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇的毛細管區帶電泳-紫外檢測方法，考查試驗參數對分離和檢測結果的影響，最佳試驗條件下，在60 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉運行緩沖液（pH=6）中，上述3種物質在8 min內完全分離，西馬特羅、鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的線性響應范圍為0.1～1.0 mg·L-1，最低檢測限（以信噪比為3計）分別為0.02，0.03和0.02 mg·L-1[29]。

5　免疫分析法

5.1放射免疫分析法

放射免疫標記技術（RIA）是采用放射性同位素的抗原或抗體來檢查相應抗體或抗原的高靈敏度免疫分析方法，此法具有高靈敏度（10-9或10-12），可進行超微量分析。本法常用同位素有3H、14C、125I和131I等。放射免疫分析法應用范圍廣泛，在食品安全檢測中可用來檢測肉類藥物殘留，黃曲霉毒素等。林杰等應用CharmⅡ放射免疫分析方法測定飼料樣品的磺胺類殘留，該檢測方法可靠，靈敏度高，特異性強，且快速簡便，在60 min內可出初篩結果，假陰性率為0，特別有助于大批量樣品的初篩檢測[30]。但是，由于該檢測方法是基于微生物受體反應，檢測結果有假陽性的可能，因此，初篩陽性的樣品必須用其他方法進行確證。CharmⅡ放射免疫分析方法作為目前一種快捷可靠的檢測手段，值得推廣應用。周浩等應用放射免疫法檢測飼料中四環素類抗生素殘留，建立快速篩選方法，確定了樣品處理及控制點設定的方法，用液相色譜質譜（LC-MS）法驗證了放射免疫分析法篩選的樣品，符合率達100%，且該方法特異性強，與氯霉素、紅霉素、鏈霉素、青霉素G、磺胺嘧啶等其他抗生素無交叉反應。飼料樣品前處理簡單、干擾因素小，只需簡單處理便可檢測，從接收樣品到出結果，整個過程約20 min，陰性結果不僅表明該樣品中含四環素族單種抗生素濃度分別<50 μg·kg-1，同時也可表明，四環素族濃度總和≤50 μg·kg-1[31]。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一種快速、有效的篩選檢測飼料中多種四環素類藥物的方法。

5.2酶聯免疫吸附法

酶聯免疫分析法（ELISA）是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種酶聯免疫技術，根據抗原-抗體反應動力學可分為競爭性和非競爭性兩種。根據反應體系與檢測體系之間的關系分為直接法、間接法。其中間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體。李瑞園等建立了飼料中己烯雌酚定量的酶聯免疫吸附測定法，試驗結果顯示，己烯雌酚在0～4.5μg·kg-1呈現良好的線性關系，相關系數為0.9997，樣品加標平均回收率為76%～94.2%，該方法靈敏度高，適合飼料中己烯雌酚檢測，且適用于大批量樣品的篩選[32]。徐新慧等用競爭性酶免疫分析法快速定量測定43個小麥樣品中玉米赤霉烯酮毒素的含量，分析結果表明，玉米赤霉烯酮在0.5～450 μg·kg-1線性關系良好，相關系數為0.997 36[36]。賈濤等采用酶聯免疫法測定飼料中的萊克多巴胺，試驗研究表明，該方法的回收率>95%，相關系數>0.99，最低檢測限可達到0.5 ng·mL-1[34]。本方法適用于飼料及飼料添加劑中萊克多巴胺的快速測定。但由于該方法檢測結果可能出現假陽性結果，因此初篩陽性結果必須采用其他方法確認。

5.3時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）是一種新型的體外超微量分析技術。TRFIA利用了具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合物為示蹤物，代替熒光物質、酶、同位素、化學發光物質，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質、核酸探針及生物細胞，待反應體系發生后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應產物中的熒光強度。根據產物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。何明祥采用包被二抗間接競爭法，以抗SAL二抗體包被96微孔板作為固相二抗，與游離SAL間接競爭限量的以Eu3+標記的SAL-OVA抗原，建立解離增強模式的熒光免疫分析體系檢測沙丁胺醇（SAL），以利用時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）技術建立快速、高靈敏度的沙丁胺醇（SAL）全自動檢測方法，結果表明該法的靈敏度為0.04 ng·mL-1，批內和批間變異系數分別為2.2%和8.7%，平均回收率為106.5%，與鹽酸克倫、萊克多巴胺的交叉反應率分別為0.93%和0.73%[35]。由此可見，用TRFIA法檢測SAL，靈敏度高、特異性強、穩定性好，具有良好的應用前景。王超等采用時間分辨熒光技術建立高靈敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）間接競爭免疫分析法（ZEN-TRFIA），以玉米赤霉烯酮人工抗原（ZENBSA）包被96孔板為固相抗原，與ZEN標準或樣品中的ZEN共同競爭有限的抗ZEN的單抗，用稀土離子Eu3+標記的羊抗鼠抗體進行示蹤，該方法的靈敏度為0.01 μg·L-1，測量范圍為0.01～20.00 μg·L-1，批內和批間變異分別為7.2%和14.6%，平均回收率為94.4%，與玉米赤霉醇（ZER）的交叉反應率為15.16%，7條不同時間進行的ZEN-TRFIA的效應點值（ED）ED20、ED50和ED80分別為0.156±0.024、0.634±0.049和2.595±0.225 μg·L-1，試劑盒4℃保質期超過6個月，研究表明，ZEN-TRFIA是目前報道的ZEN檢測中較靈敏的方法，該分析方法穩定性好，貨架期符合要求，可測范圍寬，具有很好的應用前景[36]。Shen等通過時間分辨熒光技術（TR-FLA）從豬組織中篩查萊克多巴胺，該方法是基于直接競爭免疫法，萊克多巴胺-卵清蛋白作為固相抗原，用銪標記單克隆抗體進行示蹤，當豬肝臟和肌肉中萊克多巴胺的含量達到1～10 μg·kg-1時，回收率可達88.2%～118.5%，且其變異系數為7.1%～20.5%，檢出限為0.1 μg·kg-1。通過液質聯用法驗證，時間分辨熒光技術對檢出豬組織中的萊克多巴胺具有很好的效果[37]。

5.4化學發光酶免疫分析法

化學發光免疫分析（CLIA）方法是基于放射免疫分析的基本原理，將酶的化學發光與免疫反應結合起來，進而發展來的一種分析方法。CLIA是將發光物質或酶標記在抗原或抗體上，免疫反應結束后，加入氧化劑或酶底物而發光，通過測量發光強度，根據標準曲線測定待測物的濃度。其主要優點是靈敏度高、線性范圍寬、標記物的有效期長、無放射性危害、可實現全自動化等。李細芬研究了小分子半抗原與載體蛋白結合的方法，最終采用重氮鹽法制備出鹽酸克倫特羅的人工免疫原、包被原和酶標抗原，用人工免疫原免疫新西蘭大白兔，制備出高效價和高特異性的鹽酸克倫特羅抗體。通過優化各項實驗條件，建立了簡便、快捷、實用的鹽酸克倫特羅直接競爭化學發光酶免疫分析方法。對所建立方法的性能指標進行系統評價，考查了方法的檢測限、定量限、精密度、準確度。該方法檢測靈敏度較高，靈敏度為0.25 μg·kg-1，檢測限為0.02 μg·kg-1，批間和批內變異系數均<20%[38]。盧江等應用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，以辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫化學發光體系，建立了一種簡便、快速、高特異性的間接競爭化學發光酶免疫法用于檢測玉米中的玉米赤霉烯酮。所建立的方法分析靈敏度為0.09 ng·mL-1，批內變異系數<9.1%，批間變異系數< 14.7%，樣品的加標回收率為79.6%～97.6%，所建立的標準曲線相關系數為0.988 4，檢測線性范圍為0.104～1.69 ng·mL-1，檢測時間為60 min[39]。

6　小結

隨著人們對動物性食品需求量的增加，動物性食品中的激素殘留也越來越成為全社會共同關注的公共衛生問題。采用選擇性好、快捷的檢測手段是今后發展方向。應從源頭控制激素類物質添加，指導和幫助養殖業科學養殖，嚴格控制濫用動物抗生素和激素，在畜牧生產實踐中規范用藥，同時建立起一套藥物殘留監控體系，制定違規的相應處罰手段，有效地控制藥物殘留的發生，并發展選擇性好、快捷的檢測手段，確保動物性食品的食用安全和人類健康。

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前沿科技摘編

Determination Methods of Hormone Residues in Feeds and Animal Products

ZHAO Chunjuan, GAO Wenhui*
（College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China）

Abstract:With the fast development of livestock and animal husbandry, a variety of hormones and feed addi?tives were widely used, and harmful to public health and environment. Therefore，it was particularly important that the detection methods of hormone residues were established in feeds and animal products. This paper reviewed the detection methods of hormone in feeds and animal products.

Key words:feed; animal product; hormone residue; detection method

*通信作者：博士，教授，E-mail：wenhuigao@126.com。

作者簡介：趙春娟（1988-），女，河北張家口人，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。

基金項目：河北省科技支撐計劃項目（14227504D，14236602D-13）

收稿日期：2014-08-29

中圖分類號：S816；S872

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0084（2015）01-0009-06