不同分析技術對不同類型標本的EGFR基因突變檢測分析比較*

山西省腫瘤醫院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△# 史艷春△ 劉芳芳△

不同分析技術對不同類型標本的EGFR基因突變檢測分析比較*

山西省腫瘤醫院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△#史艷春△劉芳芳△

目的： 比較DHPLC法和ARMS技術檢測非小細胞肺癌患者3種不同類型標本的EGFR基因突變情況。方法：收集50例非小細胞肺癌患者的新鮮肺癌組織標本、石蠟切片和血液標本。分別用DHPLC法和ARMS技術同時檢測其3種不同類型標本的EGFR基因的突變情況。再用直接測序法來檢驗以上3種類型標本的EGFR基因突變情況。結果：DHPLC法與直接測序法結果大致相同，ARMS技術檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標本的檢出率差異具有統計學意義(P<0.05)，石蠟切片標本和血液標本的檢出率差異不具有統計學意義(P<0.05),(P<0.05)。ARMS技術中3種類型標本的檢出率相比，差異不具有統計學意義(P<0.05)。結論 ：ARMS技術檢測新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測序法，全血標本的DHPLC法可作為EGFR基因的初篩檢測， ARMS技術可用于無法確認的EGFR突變基因檢測。

表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)表達于正常上皮細胞表面，但許多腫瘤中常有突變型EGFR的存在，從而導致EGFR的過表達，EGFR的過表達和腫瘤細胞的轉移、侵潤、預后差等有關[1]。研究發現，EGFR酪氨酸激酶區域的突變主要發生在18到21外顯子，其中以19和21號外顯子突變為主，覆蓋突變達90%[2]。

肺癌是我國乃至世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一,其中非小細胞型肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，NSCLC包括鱗狀細胞癌(鱗癌)、腺癌、大細胞癌等。一部分非小細胞型肺癌患者對EGFR-TKI治療敏感，由于NSCLC患者的EGFR基因突變與酪氨酸激酶區域密切相關[3]。本研究小組就DHPLC法、ARMS法和直接測序法對EGFR 基因突變的檢測及其對于不同標本的檢出率進行研究分析，現報道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取我院自2014年5月至2015年5月期間收治入院的非小細胞肺癌患者50例為研究對象(均經我院病理科報告為病理診斷NSCLS患者)，其中男性37例(占74%)，女性13例(占26%)；年齡31～79歲，平均 49.2±12.7歲；包括鱗癌21例、腺癌18例、腺磷癌6例、細支氣管肺泡癌3例、粘液表皮樣癌2例；其中有吸煙史者38例，無吸煙史者12例。分別收集以上患者的新鮮肺癌組織標本、石蠟切片和血液標本各50例。

2 方 法

2.1 主要儀器設備與試劑：DNA 提取試劑盒，超凈工作臺，WAVER核苷酸片段分析儀(TRANSGENOMIC公司)，PCR儀(MJ Research公司)，移液器、低溫離心機(Eppendorf公司)，dNTP Mix(MBI Fermentas公司)，超高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen公司)，PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；7500實時PCR操作系統，全自動多功能酶標檢測儀(Thermo 公司)，ADx?-EGFR試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)等等。

2.2 實驗方法：分別用DHPLC法和ARMS技術同時檢測50例非小細胞肺癌患者新鮮肺癌組織標本、石蠟切片和血液標本中的EGFR基因的突變情況。再用直接測序法來檢驗以上3種類型標本的EGFR基因突變情況。對比分析上述3種類型標本的不同檢測方法的EGFR基因突變檢測結果，比較以上DHPLC法和ARMS技術兩種檢驗技術EGFR基因突變的檢出率、比較DHPLC法和ARMS技術兩種檢驗技術與直接測序法檢測的差異及3種不同標本的EGFR基因突變檢出率。評估最適合臨床應用于EGFR-TKI靶向治療前后的EGFR基因突變的檢測方法及標本類型。

3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件卡方檢驗對以上3種方法EGFR突變檢出率的差異進行數據分析，計數資料采用c2檢驗，以百分率(%)來表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

用DHPLC法檢測50例非小細胞肺癌患者新鮮肺癌組織標本、石蠟切片和血液標本中的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標本12例(占24%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標本11例(占22%)；用ARMS技術檢測50例非小細胞肺癌患者3種類型標本的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標本22例(占44%)、石蠟切片18例(占36%)和血液標本19例(占38%)；用直接測序法檢測50例非小細胞肺癌患者3種類型標本的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標本13例(占26%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標本12例(占24%)；DHPLC法檢測結果與直接測序法一致，ARMS技術檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標本的檢出率差異具有統計學意義(c2=4.46，P=0.035)，石蠟切片標本的檢出率差異不具有統計學意義(c2=1.71，P=0.19), 血液標本的檢出率差異也不具有統計學意義(c2=3.05，P=0.05)。ARMS技術中3種類型標本的檢出率相比，差異不具有統計學意義(c2=0.73，P=0.05)。

討 論

表皮生長因子受體對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮著重要的作用[4]。有研究表明[5]，實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達，EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。可能是由于EGFR的高表達引起下游信號傳導的增強，也可能是突變型EGFR受體或配體表達的增加導致EGFR的持續活化都有待進一步證實。

非小細胞型肺癌生長分裂較慢,擴散轉移相對較晚，但75%的患者發現時已處于中晚期，5年生存率很低。EGFR酪氨酸激酶區域的突變使得非小細胞型肺癌的治療與酪氨酸激酶抑制劑息息相關，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是目前被普遍接受的用于EGFR 基因突變的NSCLC 患者的靶向治療藥物。關于EGFR-TKI治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的國內外報道也屢見不鮮，因此對于EGFR 基因突變的檢測顯得尤為重要。目前醫學實驗室常用的幾種EGFR 基因突變的檢測方法有直接測序法(Direct sequencing)、Sanger雙脫氧鏈終止法 (Sanger測序法)、突變擴增阻滯系統(Amplification refractory mutation system，ARMS技術)、變性高效液相色譜原理(DHPLC技術)、熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization ，FISH)，本研究小組就此進行研究分析，得出以下結論：ARMS技術檢測新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測序法，而DHPLC法隨與直接測序法檢出率無太大差異，但DHPLC法操作更簡便，成本較低。全血標本的DHPLC法檢測非小細胞肺癌的EGFR基因可作為初篩檢測，對于無法確認的EGFR突變基因可采用ARMS技術檢測患者的新鮮肺癌組織EGFR基因。

[1] 王孟昭，陳閩江. 表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑對非小細胞肺癌患者中樞神經系統轉移的療效[J]. 中華結核和呼吸雜志,2014,37(3):169-171.

[2] 張永奎，竺王玉，何劍營，等. 舟山海島地區非小細胞肺癌EGFR基因19和21外顯子突變與臨床病理特征的關系[C]. 2012.

[3] 王生海. HSP90α在非小細胞肺癌中表達與EGFR基因突變在肺腺癌中關系的研究[D]. 河北醫科大學,2014.

[4] Huang Z, Wang Y, Nayak PS,etal. Stretch-induced fetal type II cell differentiation is mediated via ErbB-ErbB4 interactions,” e[J]. Journal of Biological Chemistry,2012,287,(22):18091-18102.

[5] Kumar A, Kumar M, Jaiswal R,etal. Presence of Human papilloma virus and EGFR expression does not predict response to Neoadjuvant chemotherapy in oral cancer[J]. World Journal of Surgical Medical & Radiation Oncology,2012,1(20):103-110.

(收稿：2015-06-20)

*山西省衛生廳科研課題(201201007)

肺腫瘤 @EGFR基因 基因轉變

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.051

△山西省腫瘤醫院(研究所)藥理研究室

#通訊作者