代謝組學在自發性疾病模型動物遺傳質量監測和飼料開發中的應用

王龍霞，趙先哲，喬偉偉

（復旦大學實驗動物科學部，上海 200032）

代謝組學在自發性疾病模型動物遺傳質量監測和飼料開發中的應用

王龍霞，趙先哲，喬偉偉

（復旦大學實驗動物科學部，上海 200032）

自發性模型動物是研究糖尿病、高血壓和肥胖等疾病的有力工具，但是這些特殊的動物模型容易受環境及飲食的影響而產生變異。本文通過簡要的詮釋代謝組學這一新型研究手段，介紹這種方法在發掘特殊模型動物生物標志的應用，引出其用于監測特殊模型動物遺傳質量的可行性和開發專門適用于這些特殊模型動物的飼料的必要性和前景，為以后的研究提供參考。

代謝組學；自發性動物模型；遺傳監測；飼料

目前全世界約有1/3的人飽受糖尿病、高血壓、血脂紊亂及動脈粥樣硬化等一系列代謝性疾病的折磨，這類疾病在西方國家發病率為20%～30%，在我國約為25%，從長遠看其在全球增長趨勢明顯，預計到2025年全球患糖尿病總人數達到5億，而患高血壓病總人數將達15.6億，將嚴重危害人類的健康。目前的研究結果顯示，這些代謝性疾病與生物化學代謝紊亂有著密切聯系，但發病過程和機制還尚未明了。

實驗動物作為生物醫學研究的“活試劑”，其標準化程度直接影響到生命科學研究的水平和生物醫藥的研發及其安全性評價的結果。因此，可靠的實驗動物模型在研究以上代謝性疾病與生物化學代謝紊亂有著十分重要的意義。根據目前代謝疾病領域應用的情況，可遺傳的自發性動物模型較誘發性及基因改造模型具有更多的優點，其最大的優點是完全在自然條件下發病，其病理生理改變與臨床相似度較高，疾病特征的維持也較人為誘發模型更穩定。因此我國近幾年也不斷從國外大量引入各類自發性代謝疾病動物進行繁殖以供科研需要。

自發性代謝疾病動物的繁殖培育技術及質量評價體系的完善是科研工作開展的重要保證之一。然而，由于這些代謝性疾病模型動物對飼養條件要求較高，而目前國內繁育飼養這些特殊品系動物的飼料主要還是使用普通動物的標準飼料，并無專用飼料，導致這些模型動物的繁殖障礙而供不應求。另一方面，由于自發性疾病動物模型大多是由國外引入，飼養環境的改變易使這些特殊品系動物的某些生物學特性或指標與國外的產生差異，使研究結果不能完全可信。國內目前的質量評價指標還是比較單一化，不夠全面，因此建立一套完整的質量評價指標體系對自發性代謝疾病動物的應用十分必要。

1　代謝組學在自發性疾病動物質量評價體系中的應用

1.1代謝組學與代謝指紋技術

傳統近交系實驗動物遺傳監測的方法主要有:免疫標志檢測、生物化學位點檢測、形態特征檢測等，這些方法主要原理是利用表型特征的變化來推測相應的基因變化。這些方法在精確度、檢測位點及反映遺傳概貌等方面具有一定的局限性。

DNA指紋技術作為近年興起的一種有效的遺傳分析手段有著眾多優點：①多態性比較好，所反映的基因位點更多，從而能夠更全面的反映基因組的變異性；②方法簡單，結果直觀可辨性強，穩定性好，精確性可達到個體識別；③采樣要求不高，不同的組織如血液、精液、毛發、肌肉等產生的DNA指紋圖完全一致。盡管有如此多的優點，該技術也存在著工作量大、判定標準不明確，成本相對較高，要求的設備多等很多實際工作中不可忽視的缺點［1］。

代謝組學作為一種新的組學技術，主要運用現代化學儀器和化學計量學的方法來給內源性生物樣本的代謝物進行特征定性，是機體在內源性代謝網中對于毒物或疾病的擾動所產生相應的生理病理變化的理想檢測手段［2-6］。體內小分子代謝物是系統生命活動、生物化學代謝的物質基礎，因此個體的代謝特征和疾病會表現為某些特殊代謝物在不同個體間的濃度差異。代謝組學通過定量檢測和適當的數據處理方法來研究體內小分子化合物水平及其機體基礎代謝的變化，可以發現與疾病密切相關的異常代謝途徑和特征生物標志物，通過研究和分析這些異常變化還可以為疾病發病機制的進一步闡明提供依據［7-9］。

根據不同的研究對象和研究目的不同，代謝組學可分為幾個不同的層次，分別為：代謝物靶分析、代謝輪廓分析、代謝指紋分析以及代謝組學分析。代謝物靶分析是對已知結構的特定代謝物進行定性和定量分析，結合已知的代謝途徑，分析其在代謝中的變化，得出外源性物質的刺激或疾病對該代謝途徑的影響；代謝輪廓分析是對結構、性質或代謝路徑相關的一組化合物在整個代謝網絡中的一些關鍵信息節點的定性及半定量分析；代謝指紋分析是通過不同因素條件下代謝物的指紋圖譜差異的分析，對代謝過程進行全方位描述，能更為真實準確地反映生物系統內的各種變化［10］，所以代謝指紋分析成為代謝組學最常用的研究方法之一［11］；代謝組學分析是對體內某一特定組織所包含的所有小分子代謝物進行綜合分析，是在前三者基礎上的進一步深化與整合。

1.1.1代謝指紋技術代謝指紋可以反映疾病狀態下生物流體和組織生物化學的擾動和改變，而這些擾動和改變可能與疾病的進程有關。代謝組是基因組和蛋白組的下游產物，它可以在更為靈敏的層次上研究復雜的生物樣本，并且考慮到了環境變化對生物影響的因素［12］。高通量的代謝指紋分析常用的技術包括核磁共振技術（NMR）和質譜技術（MS），這兩種方法都可以全面反映諸如血漿、尿液及腦脊液等生物液體樣本的代謝特征［13-16］。綜合考慮兩種方法的優缺點，一般情況下MS的應用比NMR更廣泛。對于代謝組學研究來說，敏感度往往是最重要的，因為較高的敏感度可以快速分析大量的代謝組片段。盡管NMR的敏感度不如MS，但是NMR可以作為MS的一個有力的補充方法對代謝組學進行研究［17］。

1.1.2NMR自1990年代末以NMR分析為主的代謝組學研究模式提出以來，NMR 在生物醫學研究領域得到了迅速發展。利用高分辨率NMR技術檢測機體內許多微量代謝組分，可得到相應的生物體代謝物信息。研究這些組分所產生的圖譜，綜合分析圖譜中信息反映的生物學意義，可以了解生物體代謝的情況［18］。代謝組學中NMR分析方法有如下優點：①不破壞樣品的結構和性質，無輻射損傷；②可選擇接近生理條件的實驗條件，如：一定的溫度和緩沖液范圍內；③可研究生物體各種具體的化學動力學過程，給出較為詳實的有關動態特性的信息；④可設計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣；⑤無偏向性，對所有化合物的靈敏度是一樣的。但是NMR也有其不可忽視的缺點，由于尿液中各代謝物的pH值和離子化程度的不同所造成的化學位移，將導致對代謝組學數據的一些錯誤詮釋［19］。

1.1.3MS由于代謝組學研究的主要是分子量小于1 000的小分子代謝產物，相對于NMR 靈敏度低及檢測動態范圍窄等不足，MS技術的優勢是: 超微量分析、快速、具有很高的靈敏度和專屬性、可以同時快速分析多個化合物、能同時提供樣品的分子量信息和結構信息、 既可定量分析又可定性分析、能有效的與各種色譜法在線聯用，成為分析復雜體系的有力手段。然而，MS也存在離子化程度和基質干擾等問題。近年，隨著質譜及其聯用技術的發展，如氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）的出現，使得MS技術重新得到關注［20-22］。

GC-MS不僅分離效率高，而且節約實驗成本，但進樣之前需要對樣品進行衍生物化學預處理，這一步驟會比較繁瑣耗時，有時甚至會引起樣品產生不可預知的變化，這一不足使其發展受到了一定限制。LC-MS 中目前應用較廣的是高效液相色譜和質譜聯用（HPLC-MS）。HPLC進樣前不需衍生物化學處理，在適用于不穩定、難于衍生化、不易揮發和分子量較大的化合物的同時也很好的解決了MS離子壓抑作用這一不足。另外，LC-MS 技術有較高靈敏度和較好選擇性，因此在代謝組學中得到廣泛應用［18，23，24］。

1.1.4代謝指紋的數據處理代謝指紋得到的圖譜產生了大量的數據，保留時間和質/荷比使得每一個樣本的數據結構都產生一個矩陣。由于每個樣本都有成千上萬的數據與之對應，加之夾雜著眾多的干擾因素，如噪音、儀器誤差和繁雜的多余數據。采用常規統計分析方法難以發現樣品之間的異同和樣品中究竟哪些組分不同，因此需要特殊方法對代謝組學數據加以分析。一般來說，可以采用主成分分析，聚類分析等方法進行分析，其中應用最為廣泛的是主成分分析方法［7，25，26］。

1.2代謝組學技術在腫瘤方面的研究應用

目前，代謝組學在腫瘤方面研究的比較多，主要作為腫瘤診斷，預后和治療評估等的生物標志測定的有力工具［27］。由于一些代謝出現變化早于腫瘤的轉變，通過對腫瘤生物標志物的測定來診斷早期的腫瘤，對于腫瘤代謝組學研究是一個極大的推動力［28，29］，當然，同樣重要的是為腫瘤的早期干預明確了目標［30］。

以前列腺癌骨轉移為例［31］，前列腺癌骨轉移是前列腺癌重要的臨床特征之一，而目前沒有一個有效手段能在該病發生轉移的可治愈期，做出明確診斷。用GC-MS的方法將前列腺癌骨轉移病人和對應未發生骨轉移的血漿和骨組織標本進行處理，用化學計量學和生物信息學的方法進行數據分析，并用骨轉移病人和未發生骨轉移的其他癌癥病人骨組織代謝物作比較，發現這些代謝物有顯著差異，如前列腺癌骨轉移病人的平均膽固醇水平在127.30 mg/g，而其他癌癥骨轉移和正常骨組織的膽固醇平均水平為81.06 mg/g和35.85 mg/g（P=0.000 2和0.001）。根據上述研究和以前的文獻，我們可以把膽固醇作為晚期前列腺癌治療的藥物作用靶點。

另外，代謝組學作為腫瘤類型的一項識別技術，目前在乳腺癌診斷方面的優勢比較突出［27］。根據一些NMR的研究，從乳腺組織活檢中可以檢出多于30種的內源性代謝物，其中可以確信的是總膽固醇水平升高對乳腺癌的影響（可能起因于膽堿磷酸水平的升高）［28］。

張鴻德等［29］將代謝組學技術用于宮頸癌和正常人血清的研究，宮頸癌組中的檸檬酸、丙酮酸、乙二酸、3-羥基丁酸、亞油酸、乳酸、甘油、丙氨酸和十六酸水平升高（P＜0.05），賴氨酸與核糖醇含量明顯降低（P＜0.05）。腫瘤細胞生長很快，過快的生長使細胞經常處于缺氧狀態，導致線粒體的有氧氧化功能關閉，能量需求通過葡萄糖的無氧酵解提供，此反應稱為瓦伯格效應（Warburg Effect），從而使得宮頸癌組中的乳酸和丙酮酸升高。十六酸、亞油酸、油酸作為細胞膜的重要組成成分，其含量水平升高可能與腫瘤患者內細胞增殖、壞死和凋亡緊密相關。此代謝物可能成為宮頸癌早期診斷潛在的生物標志物。

盡管代謝組學技術目前得到了大大的提高，在臨床診斷依據中獲得越來越多的支持。但是，代謝組學仍然處于起步期，其技術限制，數據庫的不完善和費用問題使得其落后于其他組學，今后的發展將圍繞這些展開［32］。

1.3糖尿病和高血壓常用特殊動物模型與對照動物

的代謝標志物差異研究

1.3.1db/db小鼠db/db小鼠作為常用的Ⅱ型糖尿病和糖尿病腎病的疾病模型，該小鼠純合體在1月齡左右開始貪食發胖，血漿胰島素在10～14 d、血糖在4～8周開始升高，該模型的“三多一少”癥狀比較明顯，跟人類Ⅱ型糖尿病最為接近。由于ob/ob小鼠和db/db小鼠在代謝上有量和時間的差異［33，34］，因此在這里僅對db/db小鼠與其對照小鼠db/m的代謝差異進行探討說明。

孫立業等［35］用基于NMR的代謝組學技術以db/m小鼠為對照，對db/db 糖尿病腎病小鼠血漿中內源性小分子代謝物進行分析，結合模式識別技術確定糖尿病腎病小鼠機體由于病理刺激而產生的代謝紊亂，進行潛在代謝標志物分析，經多元統計分析（OPLS-DA的方法），與對照小鼠相比較，結果顯示db/db 小鼠血漿中葡萄糖和氧化三甲胺（TMAO）的含量升高，脂蛋白、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、賴氨酸、乙酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、甘油磷酸膽堿、磷酸膽堿、甘油的含量下降，這些都可以作為新的潛在的代謝標志物。

1.3.2Zucker（fa/fa）大鼠主要表現為高胰島素血癥、高血糖、外周胰島素抵抗、高血脂、肥胖和高血壓［36］，廣泛用于糖尿病并發癥及代謝綜合征的研究。

國外有學者將20周的Zucker（fa/fa）大鼠和普通Wistar大鼠的血漿代謝情況進行比較［37］，采用1HNMR、HPLC-MS和GC-MS三種方法，使三者優勢結合以得到更全面的代謝數據。結果表明三種方法均能很好的區分兩種大鼠的血漿代謝物的不同。在諸多標志物中，與Wistar大鼠相比，Zucker大鼠由于脂類合成的調節失常，血漿中膽固醇、花生四烯酸、油酸、棕櫚酸、低密度及極低密度脂蛋白明顯升高；維生素E的含量有所增加，維生素E具有抗氧化的作用，在疾病狀態時氧化應激產生維生素E，是機體的一種防御能力。另外Zucker大鼠的牛黃膽酸酸濃度也有所增加，可能是因為肝臟生物化學的改變而導致的膽汁酸產生形式的改變。1.3.3SHR大鼠SHR大鼠是目前較為公認的與人類高血壓最為接近的高血壓疾病動物模型。對于高血壓患者的腦損傷及功能障礙情況雖然不能完全復制，但是其很多特點都與人類高血壓患者相似，如發病機制、外周血管阻力變化、高血壓心血管并發癥、對鹽的敏感性等。但其不足之處也不可忽視，例如，成模率不高，與遺傳因素高度相關以及在飼養環境變動的情況下易變種、斷種等［38］。所以對此類大鼠的遺傳質量檢測就顯得非常重要。

Akira等［39］和Fujiwara等［40］用1HNMR代謝組學的研究方法，研究早期SHR大鼠體內的代謝變化，研究共同表明，與非高血壓大鼠相比，SHR大鼠早期體內的檸檬酸鹽和琥珀酸鹽水平顯著降低，這些變化被認為是由血壓的升高而產生的，即便大鼠品系之間的差異不能被排除，提示這兩種小分子化合物可以成為SHR大鼠早期監測的生物標志。

2　代謝組學用于特殊品系動物飼料開發

由于自發性代謝疾病動物較對照品系實驗動物其體內代謝存在差異，因此對飼料營養的需求也會不同，但是目前對這些特殊品系動物的培育主要還是使用普通品系實驗動物的標準飼料，導致這些特殊品系實驗動物的產量達不到科研的需求，另外也易影響疾病特征的穩定性。

近年來，飼料中的營養價值主要通過消化試驗、化學分析、代謝試驗、平衡試驗和飼養試驗來評定。隨著化學分析手段的不斷發展和測試儀器設備的不斷更新進步，HPLC、氨基酸自動分析儀、原子吸收光譜儀已被廣泛用于飼料營養成分分析［41］。代謝組學技術在動物營養和飼料領域的應用剛剛起步，它通過研究與營養密切相關的糖代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等，進而在分子水平上研究營養素對動物的生理機能的影響。在特殊品系動物飼料開發中，可根據動物不同生長階段的代謝指紋圖譜，進行營養需求評估模型的構建，最后完善代謝組學技術應用于實驗動物遺傳質量控制和飼料研制的流程。

魚粉由于氨基酸種類齊全比例適當，消化率高，適口性好，對于幼年動物的生長發育及成年后的營養維持具有良好的作用，是目前飼料中常用的動物蛋白來源，因此市場需求量大，價格較高，不良商家通過摻假而謀取利益，再加上其原材料易受環境污染（可能含有甲基汞和砷類化合物），從而影響實驗動物的繁育以及對實驗結果會產生很大的影響［42］，比較現有飼料配方全植物配方飼料具有原材料質量易控制且營養含量穩定的優點，全植物配方飼料替代現有飼料也是目前一大趨勢，所以應抓住這個契機進行全植物配方飼料的研制。

目前大豆飼料被認為是魚粉飼料的理想代替品之一［43］，原因在于，除了限制性氨基酸蛋氨酸外，組成大豆蛋白的其余各種必需氨基酸的比例與完全蛋白質接近，表明大豆蛋白是一種優質的蛋白質。目前對大豆蛋白的研究還比較局限，主要集中在水產養殖飼料和家畜飼料中動物性蛋白的替代上，原因在于大豆中含有多種抗營養因子，如: 植物凝集素、胰蛋白酶抑制劑、低聚糖和抗原蛋白等，這些抗營養因子如果沒有經過任何的加工處理，對動物的生長會產生極大的影響，因此也限制了大豆蛋白在動物飼料中的使用。針對大豆蛋白的缺陷，可利用微生物發酵技術對大豆進行發酵，所產生的豆粕既無化學殘留物的顧慮，也使得抗營養因子得到了有效去除，同時還能產生多種小肽，對幼畜的生長有較好的促進作用［44］。

對有毒飼料、新飼料和受到污染的飼料需要進行毒理學試驗，以評價它們對使用此種飼料的動物的安全性和對人類動物源性食品的安全性。以往在飼料毒理學研究上，通常使用三致試驗的評價方法，這種方法是建立在傳統的實驗生物學基礎上的，對毒物的代謝機制有時并不清楚，而且實驗周期較長。上述代謝組學的特征表明，代謝組學正好可以彌補三致試驗的缺陷［45］，成為更好的研究手段。

另外，代謝組學還可應用于飼料加工方法的評價，在經過加工及滅菌之后的飼料其營養成分、可消化性以及抗營養因子毒作用強度較之前都會產生一定程度的變化，如具有熱敏感特性的營養成分維生素在高溫高壓等加工過程中會有所損失；對大豆進行發酵，可使其中的植物凝集素、胰蛋白酶抑制劑等可得到不同程度的去除。代謝組學技術可以通過檢測實驗動物代謝物中的代謝變化，來評估飼料加工后飼料營養價值和安全性，從而評估飼料加工及滅菌方法的優劣［46］。

3　展望

代謝組學作為一個新興的組學，在臨床上的應用效果已證明其在代謝性疾病領域研究的優越性。代謝組學可通過定量檢測以及合適的數據處理方法（主成分分析）來研究體內小分子化合物水平及其機體基礎代謝的變化，可以發現與疾病密切相關的異常代謝途徑和特征生物標志物，研究和分析這些異常變化還可為進一步闡明代謝性疾病發病提供全面的依據。因此代謝組學技術對自發性代謝疾病動物質量評價指標體系的建立將發揮重要的作用。在動物飼料開發方面，使用代謝組學分析平臺可以彌補先前這方面小分子代謝物在動物營養學中分析技術的不足，并且其作用日漸突出。

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［46］ 曹平華，李曉霞，王占彬，等. 代謝組學在動物營養和飼料領域中的研究進展［J］. 中國畜牧獸醫，2010，（09）:20-24.

The Application of Metabonomics in Genetic Quality Monitoring of Spontaneous Disease Animal Models and Development of Specialized Feed

WANG Long-xia，ZHAO Xian-zhe，QIAO Wei-wei
（Department of Laboratory Animal Science，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Hereditary spontaneous disease animal models are powerful tools for the study of diseases like diabetes mellitus，hypertension and obesity etc. However，these special animal models are prone to be influenced by environment and diets. In this review，the metabonomics，a new research tool，to be used in discovering the biomarkers of these special animal models were introduced. The practicability of using these biomarkers to monitor the genetic quality of these special animal models and the necessity of developing the appropriate feeds for them were explained，so as to provide some

for future research.

Metabonomics ；Spontaneous Disease Animal Models；Genetic monitoring；Feed

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0258-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.017

2014-11-25

王龍霞（1988-），女，在讀碩士研究生，主要從事實驗動物營養的研究。E-mail: 12211120002@fudan.edu.cn

喬偉偉（1968-），男，副主任技師，碩士生導師，從事實驗動物的教學、科研及管理。E-mail: qiaoww@shmu.edu.cn