H PLC測定清潔驗證殘留物非諾貝特的含量

洪麗萍 黃加秀 蔡亞蘭 宗艷艷 謝春娟

（揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321）

H PLC測定清潔驗證殘留物非諾貝特的含量

洪麗萍 黃加秀 蔡亞蘭 宗艷艷 謝春娟

（揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321）

目的：建立清潔驗證中殘留物非諾貝特含量測定的高效液相色譜法。方法：色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為水（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）-乙腈（30∶70），檢測波長：286 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果：非諾貝特在0.09～ 0.90 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.999 4；回收率：99.69%，RSD=0.16%（n=9）。結(jié)論：該法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于清潔驗證殘留物非諾貝特的定量分析。

高效液相色譜法；清潔驗證；殘留物；非諾貝特

非諾貝特是降低三酰甘油的首選藥物之一[1]，為第2代苯氧芳酸類藥物，與吉非貝齊、苯扎貝特同屬于貝特類調(diào)脂藥物，于1998年在美國上市。非諾貝特可顯著降低三酰甘油（TG）、適度降低總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，并能升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，發(fā)揮良好的調(diào)脂作用，因而在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。其制劑非諾貝特緩釋片是揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的主打暢銷品種，用于調(diào)血脂，適用于經(jīng)適當(dāng)和正規(guī)飲食療法不能控制的高膽固醇血癥和/或高三酰甘油血癥，因其顯著療效而受到廣大患者的一致好評。本研究主要圍繞非諾貝特緩釋片清潔驗證中的殘留物非諾貝特開展研究，本研究參考《中華人民共和國藥典》[2]和原國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH04472014對主要活性成分非諾貝特的含量方法進(jìn)行了研究，通過對非諾貝特緩釋片生產(chǎn)用設(shè)備清潔驗證的檢驗，確定該方法可以用于該產(chǎn)品清潔驗證殘留物的檢測，保證清潔驗證的準(zhǔn)確性，并對每個驗證參數(shù)設(shè)立可接受標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明高效液相色譜法（HPLC）簡便，準(zhǔn)確，可以用于清潔驗證殘留物非諾貝特的定量分析。

揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)非諾貝特緩釋片的固體制劑生產(chǎn)車間，是根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》及可生產(chǎn)品種特性、工藝流程及相應(yīng)法律制度要求，對廠房、生產(chǎn)設(shè)施和設(shè)備進(jìn)行了合理設(shè)計和布局，設(shè)計為多品種共線生產(chǎn)。依據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》第四十六條（為降低污染和交叉污染的風(fēng)險，廠房、生產(chǎn)設(shè)施和設(shè)備應(yīng)當(dāng)根據(jù)所生產(chǎn)藥品的特性、工藝流程及相應(yīng)潔凈度級別要求合理設(shè)計、布局和使用，并符合要求）規(guī)定，對生產(chǎn)安全和有效性進(jìn)行風(fēng)險評估，以期對生產(chǎn)安全風(fēng)險能正確認(rèn)識并采取降低安全風(fēng)險意見的控制措施，使生產(chǎn)質(zhì)量及風(fēng)險降低到可以接受的水平。進(jìn)行風(fēng)險評估所用的方法遵循失效模式與影響分析技術(shù)（FMEA），包括：①分析藥物活性成分（APIs）及活性物質(zhì)溶解度是否為該生產(chǎn)線所生產(chǎn)品種中最低的，即是否為最難清潔的成份；②理論殘留限度是否為參照物組中最低限；③根據(jù)①、②分析，得出初步結(jié)論，評估是否需要開展清潔驗證。

根據(jù)《藥品生產(chǎn)驗證指南》，本次采用生物學(xué)活性限度，即最低日治療劑量（MTDD）的1/1 000作為確定最低殘留量的依據(jù)。清潔的目的是保證在使用產(chǎn)品B時，不出現(xiàn)A產(chǎn)品的生理作用。B產(chǎn)品每天服用次數(shù)多，安全性下降，因此，上述MTDD的l/1 000系指B產(chǎn)品最多日使用制劑數(shù)中允許A產(chǎn)品殘存的量，不超過因服用B產(chǎn)品而帶入體內(nèi)的A產(chǎn)品的最低日治療劑量的l/1 000。MTDD數(shù)據(jù)來自藥品標(biāo)簽和使用說明書上的有關(guān)數(shù)據(jù)計算：

MTDD＝ 每次給藥片（粒）數(shù) ×每片有效成分含量 ×每日最少給藥次數(shù)。

根據(jù)MTDD計算單位面積殘留物限度的過程如下：

①將相關(guān)設(shè)備生產(chǎn)的所有產(chǎn)品列表，在表中相應(yīng)位置填寫MTDD（mg），最小生產(chǎn)批量B（kg），單個制劑的質(zhì)量Uw（g）和每日最多使用制劑數(shù)Dd；

②計算設(shè)備內(nèi)表面積SA（cm2）；

③取最小批量B為計算參數(shù)；

④取對應(yīng)產(chǎn)品單位制劑質(zhì)量Uw和日最大使用成品（制劑數(shù)）Dd為計算參數(shù)；

⑤計算該批產(chǎn)品理論成品數(shù)U：

U＝1 000 B/Uw；

⑥計算設(shè)備表面殘留物限度Ld：

Ld＝ 允許殘留物總量/SA；

公司共線產(chǎn)品相關(guān)信息見表1。公司共線產(chǎn)品化學(xué)殘留計算結(jié)果見表2。

表1 共線產(chǎn)品信息

表2 公司共線產(chǎn)品化學(xué)殘留計算結(jié)果

經(jīng)對以上所列2個產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險評估，鹽酸西替利嗪片的設(shè)備與非諾貝特緩釋片共用，清潔方法較非諾貝特緩釋片易清潔，能滿足限度要求，無交叉污染的風(fēng)險，因而需對非諾貝特緩釋片進(jìn)行清潔驗證，并對殘留物非諾貝特進(jìn)行檢測以確定殘留量是否超過限度，從而評價清潔是否有效，找到準(zhǔn)確可靠的定量檢測非諾貝特殘留量的方法并通過對檢測方法進(jìn)行驗證考察，可確認(rèn)目前揚子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司采取的防止污染和交叉污染、防止混淆與差錯的措施適用于公司日常生產(chǎn)操作，可以確定該公司固體制劑生產(chǎn)車間用于多產(chǎn)品的生產(chǎn)是可行的，無交叉污染的風(fēng)險。

DES都是通過氫鍵受體和氫鍵供體通過氫鍵連接成的混合鹽溶液。最常用的氫鍵受體是季銨鹽類的氯化膽堿，氯化膽堿價格低廉、可生物溶解、安全無毒，可以從生物質(zhì)能源或者化石能源中提取。氯化膽堿可以與尿素、丙三醇、多元醇等安全廉價的氫鍵供體結(jié)合形成DES(見圖5)。

非諾貝特緩釋片生產(chǎn)用設(shè)備清潔驗證的效果評價是通過HPLC進(jìn)行的，采用擦拭法取樣。

擦拭取樣的殘留量=設(shè)備中的總殘留限度/設(shè)備總內(nèi)表面積，

計算得出非諾貝特緩釋片清潔驗證中殘留物非諾貝特的殘留限度L=0.059 μg/cm2，試驗中模擬設(shè)備材質(zhì)的平板面積為100 cm2，溶于10 mL的乙醇中，其Ld值為0.59 μg/mL，因此以0.59 μg/mL作為殘留物非諾貝特的取樣回收率試驗濃度。

1 試驗儀器與試驗樣品

瑞士 Mettler Toledo XP205電子天平，美國GF315振蕩器，美國安捷倫公司的Agilent1260高效液相色譜儀。

非諾貝特對照品（批號：100733-200401，含量：100.0%，來源：中國食品藥品檢定研究院）；乙醇（AR，批號：20141023，廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（AR，批號：20140305，廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC，批號：1734530416，廠家：默克公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相配制：水（磷酸調(diào)節(jié) pH至 2.5）-乙腈（30∶70）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm。

2.2 線性關(guān)系試驗

Y=52.956 X＋ 0.344 9，

相關(guān)系數(shù)r2=0.999 4；結(jié)果表明該方法在0.09～ 0.903 8 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，考慮進(jìn)樣體積為20 μL，表明該方法進(jìn)樣量在1.8～ 18 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 線性溶液的配制

表4 線性溶液的配制

2.3 定量限

線性研究中合適濃度的溶液逐步稀釋，確定定量限：移取線性檢測項下L8溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，配制成濃度為0.090 4 μg/mL的溶液，作為定量限檢測溶液，結(jié)果定量限為 1.8 ng；S/N=10.3。

2.4 精密度試驗

取濃度為 0.6 μg/mL的非諾貝特對照品溶液，按方法操作，重復(fù)測定6次，結(jié)果6次測定的RSD值為0.2%，表明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取濃度為 0.602 5 μg/mL的供試品溶液,在 25℃下放置考察，放置0，4，8，24 h之后分別測定1次，共測定4次，4次峰面積值的RSD值為0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗

取已知含量的非諾貝特對照品溶液9份，分別精密加入一定量的非諾貝特對照品溶液（濃度為0.48，0.60，0.72 μg/mL）各3份，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，根據(jù)測得峰面積值計算測得濃度，測得濃度與理論濃度之比即為回收率，計算RSD值，計算得平均回收率為99.69%，RSD為 0.16%，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果（n=9）

3 結(jié)論

非諾貝特緩釋片清潔驗證中HPLC測定非諾貝特定量限為1.8 ng，即0.09 μg/mL。線性濃度范圍為0.09～ 0.90 μg/mL；樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。試驗的驗證結(jié)果表明HPLC測定清潔驗證殘留物非諾貝特的含量紫外光度法（UV）測定可行，該方法可用于非諾貝特的定量分析。

同時在清潔驗證中需要注意：①要不斷加強對員工在日常工作中的培訓(xùn)與管理，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作的意識和行為，確保有效的清潔和清潔狀態(tài)維護(hù)。②在清潔驗證工作中，需做好清潔驗證中清潔效果的有效性及可行性確認(rèn)工作，特別是對于新增的產(chǎn)品、改變批量的產(chǎn)品、變更設(shè)備等重要情況需要作好質(zhì)量風(fēng)險評估以確定驗證內(nèi)容的范圍和深度以及在新的情況下生產(chǎn)車間多產(chǎn)品共用的可行性，重點放在檢查防止污染和交叉污染、防止混淆與差錯的措施并評估其適用性和有效性上。

[1] 李芳，俸靈林，閻超.非諾貝特制劑研究進(jìn)展[J].世界臨床醫(yī)藥，2011，32（9）：552-557.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

Determination of Fenofibrate Residues in Cleaning Validation of Fenofibrate Sustained-release Tablets by HPLC

Hong Liping，Huang Jiaxiu，Cai Yalan，Zong Yanyan，Xie Chunjuan（Yangtz River Pharmacitical Group Co.，Ltd.，Jiangsu Taizhou 225321，China）

Objective：To establish a method for the content determination of fenofibrate residues in the cleaning validation of fenofibrate sustained-release tablets by HPLC.Methods:Separation was carried out using Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）column with phosphoric acid solution（pH=2.5）-acetonitrile（30∶70）as the mobile phase，the detection wavelength was at 286 nm，the flow was 1.0 mL/min and the column temperature was at 25℃ with sample size of 20 μL.Results:The linear range of fenofibrate concentration was from 0.09 to 0.90 μg/mL and the correlation coefficient was 0.999 4.The average recovery of samples was 99.69%and RSD was 0.16%（n=9）.Conclusion:This method is convenient and accurate without interference and is suitable for the quantitative determination of fenofibrate residues in the cleaning validation of fenofibrate sustained-release tablets.

HPLC；Cleaning Validation；Residue；Fenofibrate

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.08.007

2015-05-28）

洪麗萍，女，藥師。研究方向：藥物分析和標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：hongliping@yangzijiang.com