丹酚酸B對高糖培養腎小管上皮細胞轉分化的影響及意義*

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丹酚酸B對高糖培養腎小管上皮細胞轉分化的影響及意義*

**通信作者 E-mail:smjtyf@126.com

網絡出版時間：2015-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150420.1847.012.html

張昌志， 石明雋**， 王圓圓， 劉麗榮， 肖瑛， 石春花， 嚴瑞， 郭兵

(貴陽醫學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討丹酚酸B對高糖誘導腎小管上皮細胞分化的影響及可能機制。方法： 體外培養大鼠腎小管上皮細胞NRK52E隨機分為正常糖(NG)組、高滲(HM)組、高糖(HG)組和高糖+Sal B(HB)組，分別培養24 h；采用免疫酶細胞化學染色對NRK52E細胞進行鑒定，MMT法檢測丹酚酸B對細胞生長活性的影響，免疫熒光細胞化學和Western blotting檢測各組TGF-β1、E-caderin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白的表達。結果： 與NG組相比較，HG組腎小管上皮細胞中TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表達增多(P<0.05) ，而E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05) ；與HG組比較，HB組腎小管上皮細胞中TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白表達減少(P<0.05) ，而E-cadherin蛋白表達增多(P<0.05) 。結論： 丹酚酸B對高糖誘導腎小管上皮細胞的上皮-間充質轉化(EMT) 有明顯抑制作用，其機制可能是通過抑制TGF-β1的表達，改善了腎小管纖維化病變的發生發展。

[關鍵詞]腎小管上皮細胞； 高糖培養； 丹酚酸B； 轉化生長因子-β1； 上皮-間充質細胞轉化

糖尿病腎病( diabeticnephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見而嚴重的并發癥，進行性發展至可導致終末期腎衰竭。DN發病機制復雜，至今仍未充分闡明，而且治療效果不佳。研究發現，在DN腎小管間質纖維化發展過程中，腎組織轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達顯著上調，并通過激活Smads等信號通路，誘導腎小管上皮細胞發生上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促使細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成增加并抑制其降解而過度沉積，從而造成廣泛的腎組織纖維化。本實驗前期研究表明，“丹芪合劑” 具有明顯改善DN的功效，延緩了病變的進展，但療效機制不甚清楚。丹酚酸B是丹芪合劑主藥丹參的有效成分，具有抗炎、抗凋亡，改善微循環的作用[2-3]。本實驗以大鼠腎小管上皮細胞(NRK52E)為研究對象，探討丹酚酸B(salvianolic acid B Sal B)對高糖條件下腎小管EMT的影響及其可能機制，以期為糖尿病腎病治療藥物的選擇提供實驗依據。

1材料與方法

1.1　材料和主要試劑

大鼠腎小管上皮細胞(NRK52E)，由上海復旦大學陸利民教授贈與。低糖培養基dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)，(美國Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶和青霉素鏈霉素(美國Gibco公司)，細胞培養皿(美國Corning公司)，丹酚酸B(貴州康成醫藥公司)，PVDF膜(Millipore，美國)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，熒光(TRITC)標記羊抗小鼠IgG(蘇州碧云天公司)，熒光(FITC)標記羊抗兔IgG(武漢博士德生物公司)，抗α-SMA和抗TGF-β1 (美國Stan Cruz公司)，抗Col-Ⅳ (美國CST生物公司)，抗CK-18、抗E-cadherin和抗β-actin(北京博士德生物公司)。

1.2　腎小管上皮細胞培養及鑒定

用含有10% FBS的DMEM培養液培養NRK52E細胞，接種于25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培養，待細胞生長達到90%時進行傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態。免疫酶細胞化學檢測上皮細胞標志性蛋白CK-18。

1.3　丹酚酸B對NRK52E細胞活力的影響

將NRK52E細胞懸液以5×103/100 μL接種至96孔板，待細胞生長至80%，用無血清DMEM將細胞靜止24 h，使細胞生長同步化，根據DMEM中丹酚酸B終濃度不同分為9組: 空白對照(C)組，陰性對照(H)組，0.1 μmol/L Sal B組，1 μmol/L Sal B組，5 μmol/L Sal B 組，10 μmol/L Sal B組，20 μmol/L Sal B 組和50 μmol/L Sal B 組和100 μmol/L Sal B組，每組設4個復孔，37 ℃、5% CO2孵育箱培養48 h后吸棄上清，每孔加5 g/L的MTT溶液10 μL繼續培養4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，繼續培養至顯微鏡下觀察紫色結晶全部溶解。在全自動酶聯免疫檢測儀上，檢測在570 nm處的吸光度值(實驗重復3次)。

1.4　細胞分組與處理

將傳代并靜止后的細胞隨機分為:(1)正常糖(NG)組：DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2% FBS 培養；(2)高滲(HM)對照組：DMEM(含糖5.5 mmol/L)+20 mmol/L D-Mannitol+2% FBS培養；(3)高糖(HG)組：DMEM(含糖25mmol/L)+2% FBS培養；(4)高糖+Sal B(HB)組：DMEM(含糖25 mmol/L)+ 2% FBS+Sal B(含Sal B10 μmol/L)培養，每組均培養24 h進行觀察。部分細胞接種至放入蓋玻片的6孔板進行細胞爬片培養，每一實驗組均設3個復孔，細胞處理及分組如上，用于免疫酶細胞化學和免疫熒光細胞化學染色檢測。

1.5　免疫酶細胞化學染色及免疫熒光細胞化學染色

接種至6孔板的細胞，生長融合度達80%時，更換為無FBS 的DMEM培養基培養24 h，使細胞生長同步，從孵育箱取出進行免疫酶細胞化學染色。具體過程如下：4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.1%TritonX-100打孔，室溫20 min；3% H2O2浸泡抑制內源性過氧化物酶，室溫20 min；用含10%小牛血清的PBS室溫封閉40 min；吸盡液體后加入一抗CK-18(1∶50)、E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶100)，4 ℃過夜。次日，(1)免疫酶細胞化學染色：滴加即用型生物素標記的二抗，約80 μL/每孔，室溫孵育30 min；使用DAB室溫顯色30 s～5 min；蘇木素復染15 s；脫水，透明，晾干后，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察并攝取圖像。(2)免疫熒光細胞化學染色：滴加含1% BSA的PBS按1∶100稀釋的濃縮型生物素標記二抗TRITC，37 ℃避光孵育30 min；滴加含3% BSA的PBS按1∶100稀釋的濃縮型FITC標記二抗，37 ℃避光孵育30 min；滴加DAPI染核劑37 ℃避光孵育10 min，封片，避光保存；倒置熒光顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。

1.6　免疫酶細胞化學染色

接種至6孔板的細胞，生長融合度達80%時，更換為無血清DMEM培養基培養24 h，使細胞生長同步，從孵育箱取出進行免疫熒光細胞化學染色。具體過程如下：細胞漂洗、固定、打孔、封閉如免疫酶細胞化學染色，一抗濃度E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶100)。次日，室溫30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，滴加含1% BSA的PBS按1∶100稀釋的濃縮型生物素標記二抗TRITC，37 ℃避光孵育30 min；滴加含3% BSA的PBS按1∶100稀釋的濃縮型FITC標記二抗，37 ℃避光孵育30 min；室溫下PBS洗滌3次，滴加DAPI染核劑37 ℃避光孵育10 min，PBS洗滌，封片，避光保存；倒置熒光顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。

1.7　Western Blotting檢測

細胞蛋白裂解液裂解細胞，離心取上清液，用BCA試劑盒測蛋白濃度，加樣緩沖液煮沸10 min使蛋白變性，上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入α-SMA、E-cadherin和Col-Ⅳ一抗，濃度均為1∶1 000，TGF-β1 和β-actin濃度為1∶400，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜后，加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(濃度均為1∶5 000) 室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光，凝膠成像系統(Bio-Rad)掃描采集圖片，QuantityOne軟件分析。以β-actin為內參照，結果用目的蛋白TGF-β1 、α-SMA、E-cadherin及Col-Ⅳ與相應的β-actin灰度比值表示，即相對積分灰度值對TGF-β1 、α-SMA、E-cadherin及Col-Ⅳ蛋白半定量。

1.8　統計學處理

數據采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，以均數±標準差( mean±SD) 表示，各組數據差異比較用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1　CK-18蛋白表達

免疫酶細胞化學結果顯示，在培養的NRK52E細胞中CK-18蛋白表達陽性，說明培養的細胞為大鼠腎小管上皮細胞,見圖1。

陰性對照　　　　　 　　　　　　　　　　　CK-18圖1　CK-18在NRK52E細胞中的表達 (SABC,×200)Fig.1　Expressions of CK-18 in NRK52E cells (SABC, ×200)

2.2　E-cadherin及α-SMA表達

免疫熒光細胞化學染色后，在同一個視野下切換不同的激發光發現，NG培養24 h的細胞E-cadherin表達豐富，而α-SMA表達極少；當細胞在HG環境下培養24 h E-cadherin表達降低，而α-SMA表達增多,見圖2。

注: NG代表正常糖; HG: 代表高塘圖2　糖處理24 h后NRK52E細胞中E-cadherin和α-SMA蛋白表達(SABC，×200)Fig.2　Expression of E-cadherin and α-SMA protein in cultured renal tubular epithelial cells after incubated with normal glucose and high glucose medium for 24 h

2.3　丹酚酸B對腎小管上皮細胞活力的影響

MTT實驗檢測結果顯示，100 μmol/L Sal B可增加細胞的相對活力，0.1~50 μmol/L范圍內的Sal B 對NRK52E細胞活力無明顯影響，提示上述濃度的Sal B對NRK52E無明顯的細胞毒性作用,見圖3。

圖3　Sal B對NRK52E細胞活力的影響(MTT)Fig.3　The effects of Sal B on NRK52E cell viability

2.4　TGF-β1 、E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表達

Western Blotting結果顯示，NG組與HM組之間TGF-β1 、E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表達差異無統計學意義，表明高滲對細胞生長無明顯影響；與NG組比較，HG培養24 h TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白水平較NG組顯著上調(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著下調(P<0.05)；與HG組比較，HB組TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表達下調(P<0.05) ，E-cadherin表達增加(P<0.05)。見圖4。

圖4　正常、高滲、高糖和高糖+Sal B(10 μmol/L) 處理24 h后NRK52E細胞中E-cadherin、TGF-β1 、α-SMA及Col-Ⅳ蛋白的表達(Western Blotting)Fig.4　Expression of E-cadherin, TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ protein in NRK52E cells after incubated with normal glucose, high mannitol, high glucose and high glucose plus Sal B for 24 h respectively

3討論

DN是糖尿病最常見的嚴重微血管并發癥之一，腎小球硬化和腎小管間質纖 維化為其主要病理特征，其發病隱匿，早期不易被發現，出現癥狀時腎臟的病變已經不可逆轉，如不加以有效的控制，最終將發展為終末期腎病(end-Stage renal disease，ESRD)，發生腎衰竭，只能依靠血液透析或腎移植來維持生命。由于DM發病率逐年增高，DN已成為導致慢性腎衰竭的主要病因之一。然而，DN發病機制至今尚未完全闡明，且缺乏有效的治療藥物，已成為導致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因。TGF-β1是目前已知的致纖維化作用最強的細胞因子，研究發現，在DN腎組織及高糖刺激的腎小管上皮細胞中，TGF-β1表達都顯著上調，其可通過多條通路誘導腎小管上皮細胞向間質細胞的轉分化(EMT)以及激活間質成纖維細胞，使肌成纖維細胞(myofiroflasr,MF)大量聚集并合成膠原等ECM，致使腎小管-腎間質纖維化進行性發展[4-5]。EMT是腎臟纖維化的中心環節，主要表現為腎小管上皮細胞原有的細胞表型發生改變，細胞間的緊密鏈接消失，E-cadherin表達減少，α-SMA重新表達，膠原蛋白表達增多[6-7]。本研究結果顯示，高糖處理NRK52E 24 h后，TGF-β1表達顯著增高，上皮細胞標志物E-cadherin表達明顯降低，而間質細胞標志物α-SMA表達明顯增高并伴有膠原等ECM的異常沉積，進一步證明高糖可通過上調TGF-β1的表達激活TGF-β1/Smads等信號通路，而誘導腎小管上皮細胞EMT的發生，促進腎小管-腎間質纖維化發生發展。

丹芪合劑是一種由丹參、黃芪、生地黃等中藥組成的中藥，具有活血化瘀，益氣養陰，改善腎組織局部微循環，調節機體免疫力等功效。本研究結果表明丹芪合劑能顯著改善糖尿病大鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量等腎功能指標，糾正糖尿病大鼠的血脂代謝紊亂，使糖尿病大鼠的腎重/體重比值降低，以及減輕腎小球基質增生、腎小管和腎間質損害，減少ECM的沉積，從而減輕和延緩腎小管間質纖維化發生發展，發揮腎臟保護作用[8-10]，但對其療效機制及發揮治療作用的有效成分尚未進行深入研究。丹酚酸B是丹參的有效成分，已有研究報道丹酚酸B在心血管疾病起著抑制細胞遷移、增生、擴散的作用，能有效的下調TGF-β1的表達，抑制ERK的磷酸化和血管緊張素Ⅱ受體的表達而發揮抗肝纖維化作用，也可減輕輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化程度[11-13]，亦有研究發現丹酚酸B可通過抑制TGF-β1誘導的EMT改變，發揮改善肺纖維化的作用[14]。本研究結果顯示，高糖培養腎小管上皮細胞24 h以后，腎小管上皮細胞TGF-β1的表達量明顯增加，E-cadherin蛋白表達顯著減少，并伴有α-SMA及Col-Ⅳ蛋白表達明顯增多，表明腎小管發生了明顯的EMT，而高糖培養腎小管上皮細胞予以丹酚酸B處理后，腎小管上皮細胞TGF-β1的表達量顯著減少，E-cadherin和α-SMA蛋白的異常表達逆轉，ECM的沉積減少，EMT程度明顯減輕，提示丹酚酸B可能通過下調腎小管上皮細胞 TGF-β1蛋白表達水平，發揮其抑制EMT的作用。

綜上所述，丹酚酸B對高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT有明顯抑制作用，其機制可能是通過抑制TGF-β1的表達，減輕了腎小管纖維化病變的發生發展，研究結果對進一步明確丹芪合劑及其有效成分防治糖尿病腎病的具體作用機制提供了一定的實驗依據。

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(2015-03-11收稿，2015-03-25修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

The Effect of Salvianolic Acid B on High-Glucose Induced Renal

Tubule Epithelial Cell Epithelial-Mesenchymal Transition

ZHANG Changzhi, SHI Mingjun, WANG Yuanyuan, LIU Lirong, XIAO Ying,

SHI Chunhua, YAN Rui, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Salvianolic acid B (Sal B) on the high-glucose induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) in renal tubule epithelial cells and the possible mechanism. Methods: NRK52E cells, the rat renal tubular epithelial cells, were cultured in vitro. The cells were randomly divided into normal glucose group (group NG), high mannitol group (group HM), high glucose group (group HG) and high glucose and Sal B group (group HB), and each group was cultured for 24 h. Immunocytochemistry was used to identify the renal tubule epithelial cells. MTT was adopted to the effect of Salvianolic acid B on cell growth activity. Immunofluorescence cytochemistry staining was used to assess the protein expression of E-cadherin and α-SMA. Western blotting was used to detect the protein expression of TGF-β1, E-caderin, α-SMA and Col-Ⅳ under different conditions. Results: Compared with group NG, the protein expression of TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ increased significantly(P<0.05) while the expression of E-cadherin significantly decreased (P<0.05) in renal tubular epithelium after treated with high glucose for 24 h. Compared with group HG, in group HB, Sal B decreased the expression of TGF-β1, α-SMA and Col-Ⅳ (P<0.05) and upregulated E-cadherin protein expression in renal tubular epithelium cells after treated with Sal B for 24 h (P<0.05). Conclusion: Sal B can significantly inhibit HG-induced expression of EMT through reducing the expression of TGF-β1, which may ameliorate occurrence and development of renal tubule fibrosis lesion.

[Key words]renal tubular epithelial cells; high-glucose; Salvianolic acid B; transforming growth factor betal; epithelial-mesenchymal transition

[中圖分類號]R363

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)04-0337-05

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(編號：81360116)； 貴州省社會發展攻關項目[編號：黔科合SY字(2012)3088號]； 貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項項目[黔科]合中藥字(2012)5037]