截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠肝細胞超微結構、周期蛋白Cyclin E及轉錄因子DP1的影響

黨澤方　李金霞　張秋云　崔利娟　穆凌云　高連印　杜宇瓊

作者單位: 100069北京市，首都醫科大學中醫藥學院首都醫科大學絡病重點實驗室

截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠肝細胞超微結構、周期蛋白Cyclin E及轉錄因子DP1的影響

黨澤方李金霞張秋云崔利娟穆凌云高連印杜宇瓊

作者單位: 100069北京市，首都醫科大學中醫藥學院首都醫科大學絡病重點實驗室

【摘要】目的觀察截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭(ACLF)模型大鼠肝細胞超微結構，周期蛋白Cyclin E及轉錄因子DP-1表達的影響，并考察模型24 h病死率和生存時間，從提高療效、降低死亡、改善肝細胞超微結構損傷和調控肝細胞代償性增殖的角度，分析該方干預ACLF的部分療效和作用機制。方法Wistar大鼠61只，隨機分為正常組、模型組及截斷逆挽方組。采用豬血清免疫誘導大鼠肝纖維化或肝硬化模型，再給予D-GalN/LPS一次性聯合腹腔注射進行急性攻擊，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。截斷逆挽方組在急性攻擊后給予水煎液灌胃連續3 d，模型組和截斷逆挽方組大鼠分別在4、8、12 h處死，取肝組織，進行電鏡超微結構觀察，Elisa法測定Cyclin E及其轉錄因子DP1的表達，運用IPP 6.0軟件進行圖像分析，自動計算出陽性物質的IOD值。結果截斷逆挽方可以延長模型的存活時間，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，在一定程度上減輕ACLF大鼠肝細胞超微結構的損傷;截斷逆挽方組Cyclin E、DP1 IOD值在8 h時比4 h低，12 h比8 h有增加(P<0.01)，而模型組Cyclin E、DP1 IOD則呈持續下降(P<0.05)。結論截斷逆挽方可以延長模型大鼠的存活時間，并能改善肝細胞超微結構，對肝細胞代償性增殖有一定的調控作用。

【關鍵詞】截斷逆挽方;肝衰竭，慢加急性;超微結構，Cyclin E; DP-1

項目來源:北京市自然科學基金資助項目(編號: 7112017)

E-mail: zhangqiuyun8202@ yahoo.com.cn

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是指在原有肝炎和肝硬化的基礎上發生急劇而廣泛的肝細胞壞死，主要表現為大塊或亞大塊壞死，出現以肝功能嚴重損害為主要特征的一種臨床綜合征。該病病情進展迅速、病死率高。截斷逆挽方是全國名老中醫錢英教授治療慢性乙型肝重型肝炎的經驗方，臨床研究已證實其有明確的療效［1］。前期實驗研究結果也顯示該方對ACLF模型大鼠肝功能、肝組織有保護作用，并能減少肝細胞的凋亡和壞死，降低模型大鼠的死亡率［2－5］。肝細胞異常凋亡減輕的同時，由凋亡引導的代償性增殖增強是改善肝臟壞死、挽救死亡的重要機制［6－8］。在前期工作基礎上，本研究考察該方對肝細胞超微結構、肝細胞周期蛋白E(Cyclin E)及轉錄因子蛋白1(DP1)的影響，并考察模型24 h死亡率和生存時間，從改善病理變化和調節肝細胞代償性增殖的角度，進一步闡明截斷逆挽方干預ACLF的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠61只，SPF級，雄性，體重120～150 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號: SCXK-(軍) 2007-004。飼養于首都醫科大學實驗動物科學部屏障設施動物實驗房，實驗室合格證號: SYXK(京) 2005-0022。IVC大鼠自動換氣飼養系統，分籠飼養，每籠3只，自由進食飲水。溫度(23.0±1.0)℃，相對濕度(45.0±1.0) %，每隔12 h開燈照明。動物墊料和喂養飼料由動物房提供，經高溫消毒后傳遞到實驗室，動物飲用水由動物房水處理系統處理成酸化水后給動物飲用。

1.2藥品截斷逆挽方:由苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術6 g、丹參20 g、生地20 g、黑附片15 g(先煎)組成。所有藥材均購自北京同仁堂中醫醫院中藥房，經過生藥鑒定確認后由首都醫科大學中醫藥學院實驗中心煎制，含生藥量為4.34 g/ml，4℃冰箱冷藏保存備用，使用時微溫。

1.3試劑豬血清:北京元亨圣馬生物技術研究所，批號: 120308; D-氨基半乳糖(D-galactosamine，DGalN) : 5 g，sigma公司，批號: 070M1194V;脂多糖(lippolysaccharide，LPS ) : 10 mg，sigma公司，批號: 032M4082V;羊血清原液(中杉金橋，批號: 130908)、兔超敏二步法試劑盒(中杉金橋，PV-9001，批號: K143303A)、DAB試劑盒(中杉金橋，ZLI-9018，批號: K146720D) Anti-DP1(santa cruz，sc610，批號: L2309)、Anti-CyclinE(santa cruz，sc-481，批號: E1413)。

1.4方法

1.4.1大鼠ACLF模型建立:①免疫誘導階段:大鼠適應性喂養1周后，按體重將動物隨機分為正常組6只和處理組55只。處理組腹腔注射豬血清，0.5 ml/只，每周2次，共注射13周，整個造模過程中死亡2只，死亡率0.04%。造模結束后，隨機抽取3只處理組大鼠處死，取肝右葉經10%甲醛固定后，切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下病理觀察，均達到肝纖維化/肝硬化標準(肝纖維化程度S3～S4期病理組織學改變［3］)。正常組腹腔注射同等體積的0 9%氯化鈉溶液。②急性攻擊階段:將處理組存活的50只大鼠，根據體重隨機分為模型組25只和截斷逆挽方組25只。模型組和截斷逆挽方組參照吳其愷等［6］造模方法給予D-GaLN 800 mg/kg和LP 100 μg/kg聯合腹腔注射進行急性攻擊，一次性造成ACLF模型。

1.4.2給藥及分組:截斷逆挽方組在急性攻擊前取等效劑量水煎劑連續灌胃3 d，每天2次，每次1.75 ml/只(含生藥量總計為4.34 g/ml)，正常組及模型組給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液。模型組和截斷逆挽方組在急性攻擊后，再根據體重隨機分為模型4 h組、模型8 h組、模型12 h組、模型24 h組，截斷逆挽方4 h組、截斷逆挽方8 h組、截斷逆挽方12 h組截斷逆挽方24 h組。模型24 h組和截斷逆挽方24組用于生存時間和死亡率的觀察。其中模型4、8、12組及截斷逆挽方4、8、12 h組每組均為6只。模型24組和截斷逆挽方24 h組每組7只。

1.4.3取材:急性攻擊后4、8、12 h點處各組平行取材。各組大鼠均取肝右相同部位的葉組織放入10%甲醛溶液固定24 h，進行包埋、切片。

1.4.4觀察指標與方法

1.4.4.124 h病死率及生存時間的觀察:記錄模型組、截斷逆挽方24 h組大鼠在急性攻擊后到24 h內的死亡的時間，進行統計分析，24 h后仍存活的生存時間記為24 h，并統計2組大鼠24 h內死亡數量，計算死亡率，進行比較分析。

1.4.4.2肝組織超微結構的觀察:置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中的肝組織放入4℃冰箱固定2 h以上之后，經0.1 mol/L冷磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min后將標本置入1%鋨酸繼續固定2 h。梯度丙酮脫水(70%、95%、100%各30 min，室溫)，丙烯氧化物室溫浸透2次，各30 min，丙烯氧化物與Epon2812樹脂混合物浸透過夜，Epon2812樹脂包埋，32℃聚合24 h 45℃聚合12 h，60℃聚合24 h。半薄切片經甲苯胺藍染色后在光鏡下定位。玻璃刀70 nm超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色后，在JEM-1230型透射電鏡下觀察及拍照。

1.4.4.3Cyclin E及DP1的表達:免疫組化SP法檢測肝組織中Cyclin E及DP1的表達，具體步驟按照說明書操作。先分別于400X高倍鏡下隨機選取8個視野進行觀察并照相，其中棕色部分為陽性物質，然后運用IPP6.0軟件進行圖像分析，選擇切片空白區校正并調整光源和灰度，對陽性物質進行標記，由計算機系統自動計算出陽性物質的IOD值，量化描述每個視野中Cyclin E、DP1的表達程度，取8個視野IOD值的平均值進行對比分析。

1.5統計學分析應用SPSS 12.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用獨立樣本2×2列聯表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12組大鼠24 h死亡率和生存時間比較急性攻擊后24 h內多數造模大鼠死于肝衰竭，符合ACLF死亡率高的特點。模型24 h組7只死亡6只，死亡率為85.7%;截斷逆挽方24 h組7只死亡5只，死亡率為74.1%，模型組低于截斷逆挽方組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。截斷逆挽方組存活時間明顯長于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　2組大鼠死亡率和生存時間比較n=7，h，±s

表1　2組大鼠死亡率和生存時間比較n=7，h，±s

注:與模型組比較，*P＜0.05

組別生存時間模型組15.07±4.06截斷逆挽方組　20.30±3.79*

2.2對超微結構的影響

2.2.1正常組肝細胞結構正常，細胞核圓形，位于細胞的中央，糖元豐富，粗面內質網發達，表面分布較多核糖體，肝細胞質內偶見脂滴;線粒體豐富，單位膜結構清晰，嵴稀疏短小;肝竇內皮細胞扁平，有較多窗孔;肝竇內可見到Kupffer細胞，表面有較多的突起，細胞質內可見溶酶體。見圖1。

2.2.2模型4 h組肝細胞結構尚正常，細胞核形態不規則，核膜部分凹陷，糖元及粗面內質網較正常組減少，體表核糖體少量脫顆粒。細胞質內脂滴較多;線粒體單位膜仍較清晰，嵴斷裂，但仍有部分保留;肝竇內皮細胞窗孔消失，并見基底膜形成; Kupffer細胞內溶酶體豐富，吞噬物較多，細胞體積增大。見圖1。

2.2.3截斷逆挽方組4 h組肝細胞結構正常，細胞核圓形，位于細胞的中央，未見核膜凹陷，糖元較正常組明顯減少，然粗面內質網仍較豐富，體表核糖體部分脫顆粒，細胞質內可見脂滴形成，然較模型4 h組少;線粒體單位膜仍較清晰，少量嵴斷裂，大部分仍保留;肝竇內皮細胞窗孔消失，并見基底膜形成; Kupffer細胞內溶酶體豐富，細胞體積較大。見圖1。

2.2.4模型8 h組肝細胞結構破壞，胞膜破裂，胞核皺縮，呈蟲噬狀，內部染色質凝集固縮，糖元與粗面內質網均明顯減少，體表核糖體脫顆粒明顯，有體積較大的脂肪滴散在分布，細胞質內可見炎性細胞及部分紅細胞浸潤;線粒體數量較前減少，部分形態發生變化，嵴斷裂，多數消失;細胞間連接結構破壞，可見結構不清的壞死灶; Kupffer細胞內溶酶體豐富，因吞噬凋亡小體或壞死物質胞體增大，可見到次級溶酶體。見圖1。

2.2.5截斷逆挽方組8 h組部分肝細胞膜破裂，胞核因遭擠壓移到胞質周邊部，核膜較4 h時皺縮，內部染色質凝集固縮，糖元與粗面內質網均明顯減少，體表核糖體脫顆粒明顯，但較模型8 h組少，脂滴形成較少線粒體數量較前減少，嵴斷裂，多數消失，但較模型8組破壞程度輕;出現細胞間連接結構破壞，并可見結構不清的壞死灶; Kupffer細胞內溶酶體豐富，因吞噬凋亡小體或壞死物質胞體增大，可見到次級溶酶體。見圖1。

2.2.6模型12 h組肝細胞膜破裂并消失，細胞核崩解，糖元消失，僅有少量粗面內質網保留，體表核糖體脫顆粒嚴重，脂滴大量形成。壞死灶滿視野，內部可見大量炎性細胞及紅細胞浸潤;線粒體數目明顯減少，固縮，嵴斷裂，消失; Kupffer細胞吞噬大量壞死物質胞體較前增大，次級溶酶體較多。見圖1。

2.2.7截斷逆挽方組12 h組肝細胞膜破裂并消失細胞核皺縮，內部染色質凝集固縮，未出現崩解現象糖元消失，僅有少量粗面內質網保留，體表核糖體脫顆粒明顯，脂滴大量形成，壞死灶滿視野，內部可見炎性細胞及紅細胞浸潤，但較模型12 h組少;線粒體數目明顯減少，少見固縮，多數嵴斷裂，消失，Kupffer細胞吞噬大量壞死物質胞體增大，次級溶酶體較多。見圖1。

圖1　2組大鼠肝臟超微結構變化(肝細胞×3 000，線粒體×30 000)

以上結果提示，截斷逆挽方組4 h、8 h、12 h組較相應時間點的模型組肝細胞核、糖元和粗面內質網及線粒體等破壞程度有一定的改善，說明該方對ACLF大鼠肝臟超微結構的損傷有一定的保護作用。

2.3對大鼠肝組織Cyclin E表達的影響

2.3.1正常組大鼠肝組織Cyclin E有少量表達，模型組4 h、8 h、12 h的表達均強于正常組;截斷逆挽方組的表達較正常組明顯增強，但與對應時間點的模型組比較減輕。見圖2。

圖2　3組大鼠肝組織Cyclin E表達情況(SP法×400)

2.3.23組不同時點的肝組織Cyclin E表達IOD值在4 h、8 h、12 h時點模型組明顯高于正常組，截斷逆挽方組雖高于正常組但低于模型組(P＜0.05或＜0.01)。截斷逆挽方組Cyclin E的表達在4 h時降低，8 h時明顯降低，而12 h時有所回升。見表2。

表2　3組大鼠肝組織Cyclin E IOD值比較　×107，±s

表2　3組大鼠肝組織Cyclin E IOD值比較　×107，±s

注:與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01;與4 h比較，☆P＜0.01;與8 h組比較，▲P＜0.01

組別4 h　8 h　12 h正常組(n=5)1.06±1.45　1.06±1.45　1.06±1.45模型組(n=5)　3.20±2.00#　2.48±1.65#　1.14±0.99▲截斷逆挽方組(n=4)　1.80±1.54＊△　0.80±0.59△☆　0.99±0.65☆▲

2.4對大鼠肝組織DP1表達的影響

2.4.1正常組大鼠肝組織DP1有少量表達，模型組4 h、8 h、12 h表達量均顯著高于正常組;截斷逆挽方組DP1表達量均高于正常組，但與對應時間點的模型組比較明顯減弱。見圖3。

圖3　3組大鼠肝組織DP1表達情況(SP×400)

2.4.23組不同時點的肝組織DP1表達IOD值，在4 h、8 h、12 h時點模型組明顯高于正常組，截斷逆挽方組雖高于正常組但低于模型組(P<0.05)。截斷逆挽方組DP1的表達在4 h時降低，8 h時明顯降低而12 h時有所回升。見表3。

表3　3組大鼠肝組織DP1 IOD值比較　×107±s

表3　3組大鼠肝組織DP1 IOD值比較　×107±s

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01;與4 h比較，△P＜0.01;與8比較，☆P＜0.01

組別4 h　8 h　12 h正常組(n=5)1.78±2.54　1.78±2.54　1.78±2.54模型組(n=5)　3.85±2.00*　3.53±1.88*　2.52±1.29△截斷逆挽方組(n=4)　2.71±0.87#　1.64±0.71#△　2.06±0.72△☆

3　討論

死亡率和存活時間觀察結果提示:模型組24 h死亡率為85.7%;截斷逆挽方組24 h死亡74.1%，兩者比較差異無統計學意義(P<0.05)，但后者與前者相比有降低的趨勢; 2組大鼠的存活時間比較，截斷逆挽方組明顯長于模型組(P<0.05)。可見本方對延長模型大鼠的存活時間有效。考察肝細胞超微結構的病理變化，發現截斷逆挽方組4 h、8 h、12 h組較相應時間點的模型組肝細胞核、糖元和粗面內質網及線粒體等破壞程度有一定的改善，說明該方對ACLF大鼠肝臟超微結構的損傷有一定的保護作用，與前期對肝損傷保護作用研究的結果［2，5］一致。

研究發現，ACLF的發生除肝細胞壞死外，肝細胞的異常凋亡在急性肝衰竭過程中起著重要作用［6，7］而在凋亡的作用下又可以誘導細胞的增殖，這種現象被稱為凋亡誘導的代償性增殖［8］。正常情況下，肝細胞為暫不增殖細胞群，即G0期細胞，在大量肝細胞凋亡的刺激作用下，肝細胞可迅速重新進入細胞周期，進行增殖再生。轉錄起始因子DP1以及細胞周期蛋白CyclinE都是肝細胞再生的關鍵蛋白，DP-1可以正反饋調節某些基因的轉錄，產生細胞進入S期所必需的蛋白產物，如Cyclin A、Cyclin E，其中CyclinE是肝細胞進入細胞周期(G1期)的顯著性標志［9］。在本實驗中，模型組4 h組大鼠的肝組織中DP-1和Cyclin E的表達量均顯著高于正常對照組，推測這是由于ACL大鼠大量肝細胞凋亡激活了代償性增殖調控相關的通路，從而上調了DP-1和Cyclin E的表達，到了8 h和12 h，隨著時間的推移，既往的研究結果顯示模型組大鼠肝細胞凋亡逐漸增多［3］，而本研究結果則顯示，細胞增殖的關鍵蛋白DP-1和Cyclin E表達則逐漸減少可見細胞增殖不足以代償細胞過度凋亡，則會引起肝細胞大量壞死，使實驗動物最終走向死亡。與模型組比較，截斷逆挽方4 h、8 h組DP-1和Cyclin E的表達量低于相對較低，說明其所激活的代償性增殖相對模型組少，這與課題組前期研究結果一致，因為凋亡程度較輕，所激活的代償性增殖則相對較少［3］;到達12時，截斷逆挽方組DP-1和Cyclin E表達與模型組無明顯差異，且與正常組比較差異也無統計學意義(P＞0.05)，然前期研究結果則顯示這個時間點凋亡明顯增加，可見，這時無論模型組和截斷逆挽方組代償性增殖均不能補償異常凋亡，截斷逆挽方組這個變化考慮與血藥濃度下降有關。進一步進行模型組和截斷逆挽方組的亞組分析發現，模型組4 h、8 h、12 h時間點Cyclin E、DP1 IOD值呈持續下降趨勢，且12 h最低，與4 h、8 h組比較均有統計學意義(P<0.01)，而截斷逆挽方組的變化趨勢則有所不同，Cyclin E、DP1 IOD 值8 h比4 h低，12 h的Cyclin E、DP1 iod值比8 h有所增加(P<0.01)。可見，截斷逆挽方干預后，不僅可以減輕模型大鼠的異常凋亡，在12 h時間點肝細胞代償性增殖相對8 h有回升的趨勢，這個結果提示，如果后續繼續給藥治療，有可能出現異常凋亡繼續減輕，代償性增殖逐漸增強，改善動物最終走向死亡的不良結局，然其調控代償性增殖的具體途徑及繼續給藥治療后的結果尚不確定，值得進一步研究。

課題組前期建立慢性重型肝炎“毒損肝體”的病因病機理論，認為毒瘀與正虛交織是乙型慢性重型肝炎的病機特點［10］，截斷逆挽方正是針對這個病機特點，同時采用解毒化瘀、扶助正氣的法則，運用苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草、生黃芪、槲寄生、三七、莪術、丹參、生地、黑附片等藥，達到截斷病勢，扶正祛邪之目的。腸源性內毒素血癥對肝臟的“二次打擊”是ACLF發病的關鍵因素之一，內毒素既可以直接損傷肝臟，又可以通過激活Kuffer細胞釋放細胞因子、炎性介質(如TNF-α、IL-1、IL-6)等引起肝臟炎癥及肝臟微循環障礙，從而造成肝損傷。現代藥理發現，生黃芪、黃芪總提取物、黃芪多糖等具有抑制內毒素對肝細胞的直接或間接的損傷［11－13］;生地則可以增加細胞免疫功能，有促進網狀內皮系統吞噬功能、增加外周血T淋巴細胞的作用，其有效成分水蘇糖可以加速腸道內有毒物質排出，減清腸源性內毒素對肝臟的“二次打擊”［14］;三七則可以增強免疫能力、改善肝臟微循環、減少線粒體內質網等細胞器的損傷［15］。這些藥理研究成果也可以作為截斷逆挽方減輕ACLF模型大鼠肝細胞超微結構病理變化的佐證。

綜上所述，截斷逆挽方可以延長模型大鼠的存活時間，并能改善肝細胞超微結構，對肝細胞代償性增殖有一定的調控作用。

參考文獻

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Effects of truncation and inversion prescription on the ultrastructure，Cyclin E and its transcription factor DP-1 in rats with ACLF

DANG Zefang，LI Jinxia，ZHANG Qiuyun et al.
TCM College，Capital Medical University，Beijing 100069， China

【Abstract】Objective To observe the effects of truncation and inversion prescription on the ultrastructure，Cyclin E and its transcription factor DP-1 in liver cells of model rats with acute-on-chronic liver failure (ACLF)，to explore 24-hour mortality and survival time of rat models and to analyze the therapeutic effects and action mechanism of the prescription on ACLF.Methods Sixty－one Wistar rats were randomly divided into three groups: normal control group，model group and Chinese traditional medicine group (TCM group).The rat models with hepatic fibrosis or hepatic cirrhosis were established by immune induction of pig serum，then D-GalN/LPS one-time combination intraperitoneal injection was performed to establish the rat models with acute hepatic failure.After the animal models were established，the rats were treated by truncation and inversion prescription decoction through gavage for 3 days，then the rats in model group and TCM group were sacrificed respectively at 4h，8h，12h，and the ultrastructure changes of liver tissues were observed by electron microscopy，and the expression levels of Cyclin E and its transcription factors DP-1 were detected by ELISA.The images were analyzed by IPP6.0 software，and IOD value in positive substance was automatically calculated.ResultsThe survival time in TCM group was significantly longer than that in model group (P<0.05)，furthermore，the ultrastructural injury of liver cells in TCM group was relieved at some extent; the IOD vlue and levels of Cyclin E，DP-1 in TCM group at 8h were obviously lower than those at 4h，however，which in 12h were significantly increased，as compared with those at 8h (P<0.01)，but IOD value and levels of Cyclin E，DP-1 in model group were decreased continually.Conclusion Truncation and inversion prescription can prolong survival time of model rats，and can improve the ultrastructure of liver cells，which has regulative effects on compensatory proliferation of liver cells at some extent.

【Key words】truncation and inversion prescription; acute-on-chronic liver failure; ultrastructure; Cyclin E; DP-1

(收稿日期:2014－12－20

通訊作者:張秋云，100069北京市，首都醫科大學中醫藥學院首都醫科大學絡病重點實驗室;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.01

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1285－05

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 575