RANTES基因多態性與結核性膿胸發病風險的關系

徐偉樂　馬輝　齊海亮　王娜　李輝

作者單位: 050041石家莊市，河北省胸科醫院微創外科

RANTES基因多態性與結核性膿胸發病風險的關系

徐偉樂馬輝齊海亮王娜李輝

作者單位: 050041石家莊市，河北省胸科醫院微創外科

【摘要】目的探討河北地區受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)基因-403G/A和-28C/G單核苷酸多態性(SNP)與結核性膿胸的關系。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測300例結核性膿胸患者和300例對照人群RANTES基因-403G/A和-28C/G的基因型。結果RANTES基因-403G/A SNP基因型頻率和等位基因頻率在結核性膿胸組和正常組間差異有統計學意義(P=0.004和P=0.008)，與GG基因型相比，攜帶AG+AA基因型可增加結核性膿胸發病風險(OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939)。RANTES基因-28C/G SNP基因型頻率和等位基因頻率在結核性膿胸組和正常組間差異無統計學意義(P=0.128和P=0.064)，與CC基因型相比，攜帶CG+GG基因型與結核性膿胸發病風險無關(OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936)。結論RANTES基因-403G/A SNP可能與結核性膿胸的發病風險有關，即攜帶AG+AA基因型增加結核性膿胸發病風險; RANTES基因-28C/G SNP可能與結核性膿胸發病風險無關。

【關鍵詞】結核性膿胸; RANTES基因;單核苷酸多態性

E-mail: kk20140612@126.com

結核性膿胸為胸膜腔結核桿菌嚴重感染，并產生膿性滲出液積聚所致，發病率近年來呈上升趨勢。結核桿菌侵犯胸膜組織的過程，是由多種細胞因子參與的細胞免疫過程。受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)作為重要的CC趨化因子，在炎癥部位募集和活化免疫細胞上扮演了重要角色，所以近年來RANTES基因受到人們關注［1］。本研究采用PCRRFLP的方法探討中國河北地區RANTES基因-403G/A和-28C/G SNPs與結核性膿胸發病風險的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2011年1月至2014年1月于我院微創外科行手術治療的結核性膿胸患者300例為結核性膿胸組，術后標本均經病理學證實，同時排除HIV感染者等免疫缺陷病患者，其中男165例，女13 例;平均年齡41.12歲。對照人群為同期在我院體檢中心健康體檢者300例(正常組)，其中男159例，女141例;平均年齡40.18歲。2組間年齡、性別比差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1DNA的提取:取研究對象靜脈血5 ml，經枸酸鈉抗凝，以蛋白酶消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細胞DNA。

1.2.2PCR-RFLP技術分析: RANTES-403G/A和28C/G引物均參考文獻［2］設計，由上海伯昊生化科技有限公司合成。RANTES-403G/A上游引物序列: 5’CACAAGAGGACTCATTCCAACTCA-3’，下游引物序列: 5’-AGTTCCTGCTTATTCATTACAGATCGTA-3’-28C/G上游引物序列: 5’-ACTCCCCTTAGGGGATGCCCGT-3’，下游引物序列: 5’-GCGCAGAGGGCAGTAGCAAT-3’。擴增條件:預變性94℃1 min、94℃變性20 s、退火溫度55℃30 s、72℃延伸30 s 35個循環后，最后72℃延伸7 min，循環數30。RANTES-403G/A 和-28C/G擴增產物分別經限制性核酸內切酶RsaI和HincII酶切，酶切產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在紫外成像儀下觀察、拍照并分析其結果。

1.3統計學分析應用SPSS 19.0統計軟件，正常對照組基因型頻率分布行χ2檢驗做Hardy-Weinberg平衡分析，基因型和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗，以非條件Logistic回歸方法計算表示相對風險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidence interval，CI)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1基因型分析RANTES-403G/A位點的PCR擴增片段長度為206 bp，酶切產物進行電泳，AA基因型僅見一條206 bp電泳帶，AG基因型顯示為206 bp、180 bp和26 bp三條帶，GG基因型表現為180 bp和26 bp兩條帶。-28C/G位點的PCR擴增片段長度為175 bp，酶切產物進行電泳，GG基因型僅見一條175 bp電泳帶，CG基因型可見三條帶分別為175 bp、152 bp和23 bp，CC基因型表現為152 bp和23 bp兩條帶。見圖1、2。

圖1　RANTES-403G/A位點酶切圖

圖2　RANTES-28C/G位點酶切圖

2.2正常組情況正常組的-403G/A和-28C/G位點的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞ 0.05)。

2.3RANTES-403G/A SNP基因型和等位基因頻率分布在結核性膿胸組和正常組比較該位點各基因型頻率和等位基因型頻率在結核性膿胸組和正常組之間差異有統計學意義(P=0.004和P=0.008)。與G基因型相比，攜帶AG+AA基因型可增加結核性膿胸發病風險(OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939)。見表1、2。

表1　RANTES-403G/A基因型和等位基因頻率在結核性膿胸組和正常組中比較　n=300，例(%)

表2　RANTES-403G/A SNP與結核性膿胸發病風險的關系n=300，例(%)

2.4RANTES-28C/G SNP基因型和等位基因頻率分布在結核性膿胸組和正常組比較該位點各基因型頻率和等位基因頻率在結核性膿胸組和正常組間差異無統計學意義(P=0.128和P=0.064)，與CC基因型相比，攜帶CG+GG基因型與結核性膿胸發病風險無關(OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936)。見表3、4。

表3　RANTES-28C/G基因型和等位基因頻率在結核性膿胸組和正常組中比較　n=300，例(%)

表4　RANTES-28C/G SNP與結核性膿胸發病風險的關系n=300，例(%)

3　討論

RANTES基因定位于人染色體17q11.2～12，包括3個外顯子和2個內含子，其存在多個SNP位點，其中，位于啟動子區的-403G/A和-28C/G SNPs可能會影響RANTES基因的表達水平和功能活性，從而影響機體對疾病的易感性［1］。

目前國內外關于其多態性與結核病發病風險關系已有報道，結論不盡一致。對于RANTES-403G/A SNP，Mishra等［3］發現在印度中北部Sahariya部落中-403G/A SNP與肺結核病發病風險明顯相關，攜帶A等位基因增加肺結核病發病風險，這與Sánchez-Castaňón等［4，5］研究結果一致。而Selvaraj等［6］通過對印度南部人群-403G/A SNP研究，發現-403G/A SNP與肺結核病發病風險無關，Chu等［7］對中國香港人群的研究和Mhmoud等［2］對蘇丹人群的研究得到相同結論，隨瑞枝［8］也報道了寧夏地區人群中此多態位點與結核病發病可能無關。對于RANTES-28C/G SNP，報道顯示在印度中北部Sahariya部落［3］和中國香港人群中［7］，此位點多態性與肺結核病發病風險無關，而在西班牙北部人群［4］、突尼斯人群［5］和蘇丹人群中［2］，-28C/G SNP與肺結核病發病風險明顯相關，攜帶G等位基因增加肺結核病發病風險。出現上述結論不一致的原因，考慮與RANTES-403G/A和-28C/G SNPs在不同人群、種族分布的多樣性及地域分布密切相關。上述報道多以肺結核患者為研究對象，關于RANTES-403G/A和-28C/G SNPs與結核性膿胸發病風險的關系，筆者尚未見報道。本文研究發現，RANTES-403G/A SNP可能與結核性膿胸的發病風險有關，即攜帶AG+AA基因型(A等位基因)增加結核性膿胸發病風險，而-28C/G SNP可能與結核性膿胸發病風險無關。

結核性膿胸的發病是一個多因素參與的錯綜復雜的過程，易感基因多態性是其中一個因素。進一步研究不同易感基因獨立或聯合在結核性膿胸遺傳易感性中的作用，對闡明結核性膿胸的發生機制和結核性膿胸的防治具有重要的意義。

參考文獻

1王興，隨瑞枝，張淑雅，等.寧夏回漢族人群RANTES基因多態性的分布特征.寧夏醫科大學學報，2012，34: 676-679.

2Mhmoud N，Fahal A，Wendy W，et al.Association of IL-10 and CCL5 sin gle nucleotide polymorphisms with tuberculosis in the Sudanese popula tion.Tropical Medicine and International Health，2013，18: 1119-1127.

3Mishra G，Poojary SS，Raj P，et al.Genetic polymorphisms of CCL2 CCL5，CCR2 and CCR5 genes in Sahariya tribe of North Central India: a association study with pulmonary tuberculosis.Infect.Genet Evol，2012 12: 1120-1127.

4Sánchez-Castaňón M，Baquero IC，Sánchez-Velasco P，et al.Polymor phisms in CCL5 promoter are associated with pulmonary tuberculosis i northern Spain.Int J Tuberc Lung DIS，2009，13: 480-485.

5Ben-Selma W，Harizi H，Bougmiza I，et al.Polymorphisms in the RAN TES gene increase susceptibility to active tuberculosis in Tunisia.DN and Cell Biology，2011，30: 789-800.

6Selvaraj P，Alagarasu K，Singh B，et al.CCL5 (RANTES) gene polymor phisms in pulmonary tuberculosis patients of south India.Int J Immuno genet，2011，38: 397-402.

7Chu SF，Tam CM，Wong HS，et al.Association between CCL5 function polymorphisms and tuberculosis in Hong Kong Chinese.Genes Immun 2007，8: 475-479.

8隨瑞枝.CCL5基因多態性與寧夏地區結核病遺傳易感性的關聯性研究.寧夏醫科大學.2011.

The correlation between RANTES gene polymorphism and the onset risk of tuberculous empyema

XU Weile，MA Hui，QI Hailiang，et al.
Minimally Invasive Surgery of Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang 050041，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between RANTES-403G/A and-28C/G single nucleotide polymorphism (SNPs) and the onset risk of tuberculous empyema (TE) in Hebei Province，China.Methods The gene types of SNPs of RANTES-403G/A and-28C/G were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 300 patients with tuberculous empyema (patient group) and 300 healthy subjects (control group).Results

There were significant differences in genotype frequency and allele frequency of RANTES-403G/A SNP between the two groups (P=0.004，0.008，respectively).As compared with GG genotype，the AG+GG genotype could increase the onset risk of tuberculous empyema (OR=1.403 95%，CI=1.015～1.939).However there were no significant differences in genotype frequency and allele frequency of RANTES-28C/G between the patient group and control group (P=0.128，0.064，respectively).As compared with the CC genotype，the CG+GG genotype was not correlated to onset risk of TE (OR=1.314 95%，CI=0.891～1.936).Conclusion The RANTES-403G/A SNP may be correlated to onset risk of TE，carrying G allele (AG+GG) may increase onset risk of TE.However 28C/G SNP may be not related with onset risk of TE.

【Key words】tuberculous empyema; RANTES gene; single nucleotide polymorphism

(收稿日期:2014－11－20

通訊作者:李輝，050041石家莊市，河北省胸科醫院微創外科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.008

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1311－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 561.6