Bcl-2與卵巢顆粒細胞凋亡相關性研究

藺會蘭　孫曉慧　劉俊霞　金立娟　田碩　張藝瑋　楊尊會　鐔麗霞

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

Bcl-2與卵巢顆粒細胞凋亡相關性研究

藺會蘭孫曉慧劉俊霞金立娟田碩張藝瑋楊尊會鐔麗霞

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫(yī)院

【摘要】目的比較卵巢功能減退患者和卵巢功能正常女性顆粒細胞凋亡及Bcl-2表達情況，探討卵巢功能減退的發(fā)病機制。方法選擇接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的不孕患者48例，其中卵巢功能減退患者23例，卵巢功能正常對照患者25例。于取卵日收集卵泡液，離心收集顆粒細胞培養(yǎng)，用TUNEL檢測顆粒細胞凋亡情況。免疫組化分析顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達情況。結果卵巢功能減退組和卵巢功能正常組顆粒細胞凋亡率分別為(27 ±13) %、(18±8) %，卵巢功能減退組顆粒細胞凋亡率較對照組增高(P<0.05) ;免疫組化分析顯示Bcl-2主要在顆粒細胞胞漿中表達，卵巢功能減退組Bcl-2蛋白表達較正常對照組下調(P<0.05)。結論Bcl-2可能通過調節(jié)顆粒細胞凋亡情況，影響卵泡發(fā)育及卵巢的功能。

【關鍵詞】顆粒細胞;凋亡; Bcl-2;卵巢功能

項目來源:石家莊市科學技術研究與發(fā)展指導計劃項目(編號: 131462553)

E-mail: linhl2011bs@163.com

近年來由于社會性、醫(yī)源性和自身因素的影響，卵巢功能減退發(fā)病率越來越高。尋找卵巢功能減退的發(fā)病機制對改善卵巢功能至關重要。卵泡由1個居于核心的卵母細胞及周圍的顆粒細胞和卵泡膜細胞組成。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞的增殖、分化對卵母細胞的發(fā)育成熟起重要作用。顆粒細胞凋亡與卵子閉鎖及卵巢功能減退關系密切［1］。有學者認為當顆粒細胞凋亡達10%以上時該卵泡發(fā)生閉鎖，從而影響卵巢功能［2］。本研究通過比較卵巢功能減退患者和正常女性顆粒細胞凋亡及Bcl-2表達情況，探討卵巢功能減退的發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇我院2012年10月至2013年10月接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET/ICSI)治療的不孕患者48例。納入標準:年齡25～40歲，月經周期25～35 d，B超檢查除外卵巢多囊改變、子宮肌瘤、子宮內膜異位癥聲像改變，除外發(fā)熱及炎癥疾病，除外甲狀腺疾病、腎上腺疾病及其他系統(tǒng)腫瘤等。患者簽署知情同意書。根據(jù)基礎FSH值和卵巢基礎竇卵泡數(shù)分為卵巢功能正常對照組(FSH＜8 U/L且竇卵泡數(shù)＞5 枚) 25例和卵巢功能減退組(FSH＞10 U/L或竇卵泡數(shù)＜5枚) 23例。

1.2控制性超促排卵方案卵巢功能正常患者采用常規(guī)長方案超促排卵。于前1個月經周期B超監(jiān)測排卵，排卵后7 d(月經第21～23天)開始每天皮下注射GnRH激動劑曲普瑞林(博福益普生制藥生產) 0.05～0.1 mg，14 d后根據(jù)患者的年齡、AFC及基礎血清FSH、LH、E2水平確定促性腺激素，采用重組人促卵泡素(商品名果納芬，默克雪蘭諾公司)和尿促性激素(HMG，麗珠制藥有限公司)劑量。陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小，根據(jù)卵泡發(fā)育情況，調整用量劑量直至注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)日止;卵巢功能減退患者采用短方案促排卵，在超促排卵前即月經第2天B超下進行竇卵泡計數(shù)、有無卵巢囊腫，給予GnRH激動劑曲普瑞林0.1 mg，1次/d，月經的第3天給予促排卵藥物，陰道B超開始監(jiān)測卵泡大小，直至HCG日止當1個主導卵泡平均直徑超過18 mm、2個主導卵泡平均直徑超過17 mm、3個主導卵泡平均直徑超過16 mm時給予人絨毛膜促性腺激素(HCG) 5 000或10 000 U肌內注射，36 h后經陰道超聲取卵。取卵后第3天超聲引導下行胚胎移植。

1.3顆粒細胞凋亡檢測取卵后，顯微鏡下小心剝離卵母細胞，剩余卵泡液收集于無菌試管中，2 500 r/mi離心10 min，棄上清，收集顆粒細胞用TUNEL方法進行染色:將顆粒細胞涂片用10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定30 min后PBS沖洗，放入0.3%H2O2中1 h，加入0.1% TritonX-100，4℃反應2 min，加入Tunel反應混合物37℃濕盒中反應1 h，加入DAB顯色，蘇木素復染，光學顯微鏡觀察細胞凋亡情況并計數(shù)凋亡細胞百分比。凋亡陽性細胞在光鏡下呈棕黃色，正常細胞無著色。顯微鏡下任意選取視野，共計數(shù)500個細胞計算凋亡率(凋亡率=凋亡陽性的細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)。

1.4免疫組化法檢測顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達吸取上層顆粒細胞放于PBS溶液中，1 000 r/min×10 min離心;棄上清，用1～2 ml的PBS重懸顆粒細胞，過300目細胞篩，即獲取顆粒細胞的單細胞懸液，取顆粒細胞的單細胞懸液1 ml，用6 ml含有10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，PBS漂洗兩遍后，1% Triton-100室溫孵育30 min破膜; PBS漂洗3遍后，滴加3% H2O2。室溫孵育30 min; PBS漂洗3遍后，滴加封閉液，室溫孵育20 min;移除封閉液后，滴加Ⅰ抗(1∶100) 4℃過夜; PBS漂洗3遍后滴加Ⅱ抗37℃25 min; PBS漂洗3遍后滴加SABC20，37℃20 min，再用PBS漂洗DAB顯色;最后用蘇木精復染細胞核，用1%鹽酸酒精分化，用1%氨水返藍，再經過乙醇梯度脫水、松節(jié)油透明后即可封片、鏡下觀察和采集圖像。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.12組臨床資料比較卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者年齡、促黃體生成素(LH)、睪酮比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05) ;卵巢功能減退組和卵巢功能正常組患者FSH、E2、竇卵泡數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　2組臨床資料比較　±s

表1　2組臨床資料比較　±s

注:與卵巢功能正常組比較，*P＜0.05

指標　卵巢功能減退組(n=23)　卵巢功能正常組(n=25)年齡(歲)33.24±4.62　30.82±4.12體重指數(shù)(kg/m2)　21.54±9.72　20.68±9.35不孕年限(年)　4.21±2.17　3.83±1.76 FSH(U/L)　11.48±1.06*　6.28±0.92 LH(U/L)　5.44±1.94　4.55±1.03 E2(pmol/ml)　215.49±57.38*　189.75±71.06 T(pmol/ml)　1.07±0.66　1.18±0.58竇卵泡數(shù)(枚)　6.53±1.88*14.34±3.29

2.22組顆粒細胞凋亡率比較卵巢功能減退組顆粒細胞凋亡率為(27±13) %高于卵巢功能正常組的(18±8) %，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TUNEL染色卵巢功能減退組顆粒細胞表現(xiàn)為棕黃色，正常組無著色。

2.3免疫細胞化學檢測bcl-2蛋白的表達卵巢功能減退患者顆粒細胞陽性細胞數(shù)低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。顆粒細胞著色深度低于正常對照組。見圖1。

3　討論

圖1　免疫細胞化學檢測bcl-2蛋白表達(DAB顯色×400)

卵巢功能減退是婦科常見疾病之一，近年發(fā)病率呈上升趨勢。引起卵巢功能減退的原因可能有遺傳性、免疫性、醫(yī)源性、代謝性因素，環(huán)境污染、毒物接觸及吸煙、抑郁和未產婦長期月經紊亂等，其臨床表現(xiàn)主要以閉經、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征，常伴有圍絕經期綜合征的癥狀，如潮熱、多汗、情緒不穩(wěn)定、性欲低下、陰道干澀等。處于生育期的女性提早閉經，在心理上會產生沉重包袱，影響婚姻生活質量，產生一系列心理和社會問題。卵巢功能減退的治療方法包括:卵巢組織冷凍、激素替代、中醫(yī)中藥等［3］。

卵巢中卵泡發(fā)育由始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡到成熟卵泡，其中99%的卵泡在不同階段閉鎖。對發(fā)育卵泡而言，細胞凋亡的最終表現(xiàn)為卵泡閉鎖，其中顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的重要直接原因。卵巢功能減退的主要原因就是卵巢顆粒細胞凋亡增加，卵泡閉鎖加速，卵母細胞的凋亡［4］。顆粒細胞是卵泡表面包裹的一層壁細胞，其與卵母細胞間存在復雜的連接機制，在卵丘周圍形成一個多層次的細胞網絡，與卵泡進行物質交換及細胞間信號傳導。顆粒細胞一方面運輸營養(yǎng)物質給卵母細胞，另一方面與卵泡內膜細胞共同作用分泌激素、生長因子等多種物質，影響卵母細胞發(fā)育，影響卵巢功能［5］。此外，顆粒細胞貯存并釋放的某些生長因子和特定蛋白質在卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育過程中按一定順序表達并選擇性地彌散來發(fā)揮調節(jié)胚胎發(fā)育的作用［6］。在卵泡周期性發(fā)育過程中，各個時期卵泡的閉鎖與顆粒細胞凋亡密切相關［7］。顆粒細胞凋亡增加可能影響卵母細胞的成熟，進一步影響受精和胚胎的發(fā)育潛能［8］。有研究［9］表明顆粒細胞的凋亡與卵母細胞核的成熟、受精有關。也有研究表明顆粒細胞凋亡增加可能會引起卵母細胞核成熟延遲，導致受精能力下降［10，11］。卵巢顆粒細胞凋亡是處在一個非常復雜內環(huán)境控制下完成的，并具有高度協(xié)調性，它不僅有下丘腦-垂體-卵巢軸調節(jié)作用，也有卵巢本身的旁分泌和自分泌因子的調控機制，也存在其他組織產生的影響細胞凋亡的物質的作用［12］。顆粒細胞凋亡受卵泡刺激素、黃體生成素、雌孕激素、生長因子及受體和細胞活素等因素影響。線粒體DNA缺失可能會使卵泡細胞凋亡加速而引起卵巢早衰［13］lee等［14］將鼠線粒體與卵巢顆粒細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，線粒體具有防止顆粒細胞凋亡的作用，但具體機制尚不十分清楚。本研究中卵巢功能減退患者顆粒細胞凋亡率明顯高于卵巢功能正常者。

參與細胞凋亡調控的重要基因有多種，其中B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)家族對凋亡起決定作用的。Bcl-2家族位于胞質面的線粒體外膜、內質網膜和核膜上，已知的家族成員至少有15個，抑制凋亡發(fā)生的主要成員包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等。Bcl-2基因是一種細胞凋亡信號基因，其家族成員是細胞凋亡的關鍵性調節(jié)因素。Bcl-2蛋白可存在于免疫、神經、內分泌系統(tǒng)等正常組織中，亦存在于人卵巢組織中。有研究發(fā)現(xiàn)對鼠類卵巢顆粒細胞凋亡起決定性作用［15］。對只在卵細胞表達Bcl-2而在體細胞中無表達的小鼠研究發(fā)現(xiàn)卵細胞凋亡受抑制，這些小鼠竇前卵泡的閉鎖明顯少于野生型小鼠，說明Bcl-2有保護竇前卵泡的作用，其作用機制可能是抑制卵細胞凋亡［16］。研究表明Bcl-2不僅可以通過直接抑制卵細胞凋亡或促進始基卵泡數(shù)量增多等途徑發(fā)揮其對卵泡的發(fā)育調節(jié)作用，其抗凋亡作用還可能通過卵泡內顆粒細胞發(fā)揮作用。卵巢顆粒細胞的凋亡通過線粒體途徑介導bax表達，誘導細胞色素C從線粒體釋放出來，繼而激活Caspase-3、Caspase-9，引發(fā)Caspases級聯(lián)反應，導致凋亡［17］。而Bcl-2通過抗氧化途徑起到抑制凋亡的作用［18］。有研究表明Bcl-2可以防止線粒體內Ca2+與細胞色素C向外釋放，降低細胞代謝過程的活性氧，抑制顆粒細胞的凋亡［19］。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞中特異表達Bcl-2的轉基因鼠，排卵數(shù)明顯高于對照組［20，21］。Bcl-2過表達可拮抗bax，抑制卵泡膜細胞及顆粒細胞的凋亡，促進其分泌雌、孕激素，進而控制卵母細胞凋亡，延緩卵泡閉鎖，改善圍絕經期綜合征［22，23］。動物實驗表明，當顆粒細胞凋亡導致卵泡閉鎖時，在顆粒細胞內幾乎檢測不到凋亡抑制基因的表達產物Bcl-2蛋白［24］。另外Bcl-2亦可防止一些與凋亡有關的基因被激活并抑制這些基因表達產物的功能。本研究利用免疫組化技術檢測顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達結果顯示，Bcl-2蛋白主要在細胞漿著色，呈棕黃色。在卵巢功能減退患者的顆粒細胞中，Bcl-2陽性細胞數(shù)以及著色深度顯著低于正常卵巢的顆粒細胞。推測Bcl-2可能參與卵巢顆粒細胞的凋亡過程，間接影響卵母細胞的凋亡，在卵巢早衰的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。盡管Bcl-2調節(jié)顆粒細胞凋亡的具體機制目前尚不十分清楚，但通過對Bcl-2基因的研究，并將其導入卵巢組織中，將會成為是治療卵巢功能減退的一種新方法，也可為臨床診斷確定分子靶點的研究提供參考依據(jù)。

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(收稿日期:2014－10－11

通訊作者:孫曉慧，050011河北省石家莊市第一醫(yī)院;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.010

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1316－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 7111.75