乳腺癌易感基因BRCA1／BRCA2突變的植入前遺傳學診斷研究進展

徐曉菲，張雯柯，王莉，李娜，劉迎玉，李敏，張翊昕，范俊梅，姚元慶＊

（1，中國人民解放軍總醫院婦產科，北京 100853；2，第四軍醫大學唐都醫院婦產科，西安 710038；3，天津南開大學醫學院研究生處，天津 300071）

植入前遺傳學診斷（PGD）主要指對通過體外受精（IVF）獲得的胚胎在植入子宮前進行的遺傳學檢測，檢出攜帶致病基因和核型異常的胚胎，選擇正常胚胎植入子宮內，從而獲得健康胎兒的診斷方法。PGD 是輔助生殖與遺傳學診斷相結合而形成的一種孕前檢測技術，為高風險生育遺傳缺陷患兒的夫婦選擇性植入正常胚胎，一方面阻斷了遺傳性疾病的垂直傳播，減輕社會及家庭的負擔；另一方面，避免了傳統產前診斷遺傳性疾病進行的治療性流產，羊膜腔穿刺等操作對孕婦帶來的身心傷害，更加適用于合并生育障礙的患者。目前，PGD 主要應用于單基因遺傳病及染色體異常的檢測。

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率在大多數國家占女性各類腫瘤首位。近年來其發病率在我國逐漸上升并呈年輕化趨勢。人類乳腺 癌 易 感 基 因（breast cancer susceptibility gene 1／2，BRCA1／2）是目前已知的乳腺癌高外顯率易感基因，與家族性、遺傳性的乳腺癌、卵巢癌密切相關。BRCA1／2基因同為抑癌基因，主要參與DNA 損傷修復及維護基因組完整。近年來對乳腺癌、卵巢癌高發家族分析表明，約5%～10%患者的發病與易感基因相關［1-2］，其中，遺傳性乳腺癌和卵巢癌患者中約有60%～75%伴有BRCA1／2基因的突變［3-5］，其突變屬于常染色體不完全顯性遺傳［6］。研究表明，BRCA1／2基因突變的攜帶者發生乳腺癌和卵巢癌的終身累計風險分別達到40%～87%及16%～64%［7-10］。除此之外，近年來許多相關研究同樣表明，BRCA1／2基因的突變與結腸癌、胰腺癌、前列腺癌等其他癌癥的發病相關聯［11］。

對BRCA1／2基因突變進行檢測，尋找其致病性的突變位點，及時篩選出高危病患，有助于風險評估和早期預防。另外，因突變為常染色體遺傳，雜合患者有50%的可能性將突變基因遺傳給后代，如生育攜帶BRCA1／2 突變基因的胎兒，是否選擇妊娠終止將會是家庭難以解決的問題，這一做法在許多國家無法獲得法律的許可。針對突變基因攜帶者選擇性進行第三代試管嬰兒-植入前遺傳學診斷（PGD）能夠避免這一問題的發生，從根本上有效地阻斷遺傳性乳腺癌、卵巢癌的垂直傳播。

一、BRCA1／2植入前遺傳學診斷應用回顧

BRCA1／2基因的發現是乳腺癌臨床基因篩查的一個重要轉折點，自此之后，越來越多存在乳腺癌／卵巢癌家族史的婦女開始尋求基因咨詢。1989年，Handyside等［12］成功運用聚合酶鏈反應（PCR）技術對高風險傳遞X-連鎖隱性遺傳病的夫婦成功分析了卵裂球的性別構成，并于1990年誕生了首例經PGD 的健康嬰兒。隨著這一技術的逐漸穩定，PGD 已逐步應用于200多種單基因遺傳性疾病［13］。目前，運用PGD 方法使BRCA1／2突變攜帶者避免下一代高危易感基因風險的技術方法已成功建立并證實可行。在以色列、比利時、西班牙、荷蘭等國家的生殖醫學實驗室陸續開展了遺傳性乳腺癌／卵巢癌的PGD 相關研究［14-15］。相關法律法規逐漸建立并支持該研究的發展。2003 年歐洲人類生殖及胚胎學會（ESHRE）的法律及倫理工作小組放寬了PGD 指征：可以接受對于BRCA1／2基因突變一類的遲發性疾病執行PGD［16］；2006年5月，英國人類受精和胚胎學管理局（HFEA）準許PGD 應用于低外顯率遲發性遺傳性癌癥易感疾病，例如遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合征（HBOC）［17］。社會學、倫理學家對BRCA1／2 基因植入前遺傳學診斷的遲發性、不完全外顯率以及倫理道德等各方面問題進行了一系列 的 討 論，2007 年，Menon 等［18］通 過 調 查52 名BRCA 基因突變攜帶者稱，其中39人（75%）認為可以接受并支持執行PGD，贊同HFEA 的決議。

盡管越來越多的人們關注這一技術的發展，贊成其應用，到目前僅有較少數對于BRCA 基因突變攜帶者PGD 的報道。2008 年，澳大利亞報道了第一例行BRCA1 基因突變PGD 后出生的健康男嬰［19］；2009年，Sagi等［14］對10名以色列婦女進行了植入前遺傳學咨詢（包括7 名無癥狀攜帶者及3名乳腺癌攜帶者），其中5名選擇執行PGD，最終3位成功受孕。近期，荷蘭Derks-Smeets等［15］報道稱，對70對夫妻進行了乳腺癌易感基因的PGD，其中包括男性攜帶者、無癥狀女性攜帶者以及乳腺癌患者，共720個胚胎在體外受精后進行基因檢測，其中294（40.7%）個胚胎不攜帶BRCA1 或BRCA2突變，適合移植，最終有38名健康胎兒出生。然而，兩名攜帶BRCA1突變的婦女在PGD 后不久診斷為乳腺癌。輔助生殖-PGD 使用激素后的母體安全仍需要進一步討論。

迄今為止，國內雖已開展了許多單基因遺傳病PGD 相關實驗研究，但尚未有BRCA1／2基因的臨床植入前遺傳學診斷的報道。

二、BRCA1／2基因突變PGD 技術

（一）遺傳咨詢及突變檢測

希望行BRCA1／2 突變基因PGD 的夫妻大多由于家庭成員中至少一人已發生乳腺癌或卵巢癌，或夫妻雙方至少有一人已檢測到BRCA1／2基因突變，因此，確定BRCA1／2基因突變攜帶者突變位點是進一步遺傳診斷的前提。同時，應盡可能對其他家庭成員進行遺傳檢測，以明確基因相關聯的遺傳標記，提高PGD 診斷準確性。

（二）活檢單細胞來源

進行單基因疾病PGD 活檢建議選用ICSI受精，這一過程可以避免透明帶上粘附的其他精子導致的潛在污染［20］。PGD 的另一個重要環節是更加積極的卵巢刺激，通過控制性超排卵（COH）在超聲引導下提取大量成熟卵泡。ESHRE 數據顯示，在PGD 循環過程中，提取卵細胞的平均數量為15個［21］。Vandervorst等［22］建議，當提取卵泡數不足6個時，應適當考慮取消PGD。根據ESHRE 提示，在診斷單基因遺傳病所進行的PGD 活檢中，首選非接觸性激光法打開透明帶，避免化學方法對活檢可能產生的影響［23］。取材之后需將其在室溫下停留時間控制到最少，進行單胚胎培養。

活檢一般選取第3天或6～8細胞期的卵裂球，此時細胞仍具有全能分化潛質，分析卵裂球DNA可以同時獲取來自父母雙方的遺傳信息，現已成為大部分PGD 中心的主要取材途徑。研究表明，活檢1～2個卵裂球不會影響胚胎發育［24］。除此之外，囊胚及極體活檢已成功應用于如囊性纖維化、地中海貧血等多種單基因病的PGD［25］。對于BRCA1／2基因的其他活檢來源有待進一步的研究。

（三）診斷方法

1.巢氏PCR：PCR 是最早應用于分析單細胞DNA 以診斷胚胎單基因遺傳性疾病的技術。巢氏PCR 具有內外兩對引物，分兩步進行反應，同時，外側產物能夠作為內側引物PCR 所需模板，從而使內側PCR 過程得以重復進行，目的基因產量進一步增加。Danuta 等［26］對 巢 氏PCR 及 全 基 因 組 擴 增（whole genome amplification，WGA）用于BRCA1基因突變的PGD 檢測方法進行了比較，結果提示巢氏PCR 靈敏度、特異度更高，而WGA 相對可重復性較低。

2.多重PCR：是指針對基因組多位點采用相互之間無作用的多對引物進行混合，在同一PCR 反應中可以同時擴增。該方法同樣適用于非整倍體的檢測，已成為各PGD 中心主要采用的方法。通過同時分析多個短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）進行連鎖分析，可以有效降低等位基因脫扣（allele dropout，ADO），提高PGD 準確率。

多態性連鎖標記是指位于目的基因內部或外部與基因緊密連鎖的短串聯重復序列，標記的選擇需要對夫妻雙方以及其他家人（特別是患病家屬）進行遺傳性分析。Ramon等［27］的研究運用兩個標記點對一個BRCA1 基因特異突變進行了PGD；Drüsedau等［28］分 別 設 計 了6 個（BRCA1）和8 個（BRCA2）微衛星標記對突變攜帶者進行檢測分析，對30對夫妻進行了共47次PGD 周期，并有8人妊娠。研究表明，同時分析兩個連鎖基因位點可以把ADO 降 低 為 3.5%，同 時 分 析 三 個 可 降至1.5%［29］。

3.全基因組擴增（WGA）：PCR 技術以單細胞為模板，DNA 量少，擴增效率低。WGA 旨在非選擇性的擴增單細胞全部基因組，為遺傳檢測提供足量的樣本。在PGD 中最常用的是引物延伸預擴增（primer extension preamplification，PEP）。PEP采用隨機組成的15 個堿基引物序列對基因組DNA進行擴增，為實現微量DNA 多基因位點分析和重復檢測提供了可能。1998年Wells等［30］研究表明，PEP能擴增90%以上的基因組序列。目前，WGA技術已在假肥大性肌營養不良（DMD）、甲型血友病、囊性纖維化病等單基因遺傳病中成功應用。

4.新 一 代 測 序 技 術（next-generation sequencing，NGS）：DNA 測序技術的高速發展使得測序廣泛應用于生物信息等各個研究領域，NGS主要通過將基因組DNA 分切為小片段DNA，在這些小片段DNA 分子末端連接測序接頭制備文庫，隨后通過對圖像采集分析獲得測序結果。單細胞全基因組測序正逐步應用于植入前胚胎單基因遺傳病的篩查。

三、BRCA1／2的PGD 存在的問題及解決方案

1.擴增失敗：PGD 過程中，擴增失敗率高是最主要的缺陷之一。單細胞PCR 有限的遺傳物質數量要求研究人員必須盡可能優化反應條件，以增加擴增準確性。

2.污染：污染是PCR 反應中的常見問題，PGD-PCR 中因模板量少需增加循環次數，這一過程使得污染問題更為顯著。污染主要來自于活檢材料本身以及PCR 過程中使用到的設備和試劑。為減少污染所帶來的誤診風險，每一樣本均需設立嚴格的陰性對照；卵裂球活檢在移入PCR 管前建議反復洗脫；配備專用器材；所有操作限定在無菌層流條件下進行，盡可能地閉管操作以消除外源性污染。

3.等位基因脫扣（ADO）：活檢胚胎中有一個等位基因未能完成擴增，即出現ADO 現象，尤其是對于BRCA1／2基因一類的常染色體顯性遺傳，ADO的發生使得異常突變不能被檢出，將導致假陰性結果。多態性連鎖標記是最常見規避ADO 的方法。除此之外，熒光PCR［31］、提高變性溫度、同時檢測兩個卵裂球均有報道可以降低ADO 率［32］。只有擴增效率大于90%、ADO 率小于10%的PGD 技術才可以考慮應用于臨床［28］。

4.針對BRCA1／2基因診斷的限制因素及個性化方案：BRCA1／2突變基因攜帶者雖然乳腺癌的終身發病率高，但關于攜帶者進行PGD 的爭議仍然存在。因其遲發性及不完全顯性等問題，攜帶者可以對后代進行定期檢查、盡早治療等措施干預，限制了PGD 這一過程的選擇。另外，由于IVF存在妊娠率降低、卵巢刺激以及伴隨產生的高額費用等問題，PGD 更加適用于并存不孕問題的攜帶者，以及在乳腺癌患者化療前進行。有報道稱，攜帶BRCA1 突變的女性在PGD 后診斷為乳腺癌，PGD 周期期間對母體使用激素后的安全性問題不容忽視，有待進一步完善［33］。

鑒于PGD 中單細胞遺傳物質較少，單基因檢測要求敏感度更高的實驗標準。單細胞多重PCR 結合多態性連鎖標記的方法能夠最大程度地提高擴增效率，降低擴增失敗、等位基因缺失等帶來的陰性風險，是檢測BRCA1／2基因的理想方法，已被廣泛用于BRCA1／2基因PGD［27-29］。因PGD 技術的局限性以及無可避免存在一定比例的誤診，進行植入前診斷需保證患者知情同意，醫患雙方共同承擔診療選擇和決定的風險，從而使PGD 技術遵循倫理學基本原則［34］。

四、BRCA1／2的PGD 應用前景

近十幾年來我國乳腺癌發病率逐年上升，尤其在京津滬等大中城市，乳腺癌已居女性惡性腫瘤的首位且發病年齡趨于年輕［35］。隨著輔助生殖技術的逐漸推廣，能夠從植入前水平減少基因類疾病的遺傳，實現優生優育，減輕家庭及社會負擔。PGD對BRCA1／2基因突變遺傳預防具有重要的臨床意義。PGD 技術需要在不損害胚胎發育潛能的前提下，在有限的材料上進行遺傳性分析，最終將檢測后無基因突變的胚胎植入適合妊娠的子宮中。這一復雜過程需要醫學遺傳學家、分子生物學家以及生殖醫學臨床專家的共同協作。目前，國外已有BRCA1／2基因突變攜帶者通過PGD 誕生無突變基因的健康胎兒的報道［19］，而我國PGD 研究更是具有很大潛力。我們期待隨著分子生物學、生殖遺傳學、組織胚胎學等技術的不斷發展，建立起成熟準確的BRCA1／2突變基因的PGD 技術。

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