蛋白質組學在木薯育種中的應用

陳松筆 安飛飛 朱文麗 李開綿 Luiz JCB Carvalho 李慶孝

蛋白質組學是由基因組學一詞衍生而來，即由一個基因組、一個細胞或一種組織通過轉錄翻譯表達的所有蛋白質［1］。蛋白質組學以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，從細胞水平及生物體水平研究蛋白質的組成、結構、修飾及其功能［2］，從而在蛋白質水平探索其作用模式、功能機理、調節調控及相互作用［3］。近年來，蛋白質組學技術取得了長足的發展，隨著新技術的不斷涌現，其應用范圍也不斷擴大［4］。本文對蛋白質組學在木薯育種中的應用進行綜述，并對其應用前景進行展望。

1 蛋白質組學工作平臺

1.1 蛋白質組學及其主要研究內容

1994年，澳大利亞麥考瑞大學（MacquarieUniversity）的Wilkins和Williams首次提出了蛋白質組學概念，他們把蛋白質組定義為基因組表達產生的全部蛋白質，即某一個物種、個體、器官、組織或細胞基因組表達的全部蛋白質［5］。基因選擇性表達及轉錄、翻譯過程中的修飾，導致蛋白質隨組織、發育時期和生長環境的不同而發生變化。這些變化不僅反映在蛋白質的豐度上，也反映在蛋白質翻譯后的修飾和相互作用上［6］。蛋白質組學最有價值的優勢是可以觀察特定時間內一個完整蛋白質組在某種生理或病理狀態中發生的相應變化［7，8］。目前蛋白質組學研究范疇主要包括四個方面：結構蛋白質組學（Structural proteomics）、表達蛋白質組學（也稱比較蛋白質組學，Expression proteomics）、相互作用蛋白質組學（Interaction proteomics）和功能蛋白質組學（Functional proteomics），其中表達蛋白質組學應用比較廣泛［9，10］。

1.2 蛋白質組學研究技術

1.2.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 雙向電泳技術（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）是 O’Farrell在1975年建立［11］。到目前為止，仍然是全蛋白質分離的核心技術。其原理是根據不同蛋白質的等電點及分子量進行分離。優點在于：分辨率較高，最好的凝膠能夠分離到10 000個點以上［12］，還可以對翻譯后修飾（如糖基化、磷酸化等）進行分析。缺點是高豐度蛋白質點往往遮蔽掉稀有蛋白質和低豐度蛋白質，導致2-DE方法分離蛋白質靈敏度降低，尤其對疏水性蛋白質、極酸和極堿蛋白質分離效果不是很好。為提高2-DE方法靈敏度，可通過增加雙向膠分辨率，分辨出具有相似等電點的蛋白質。對極高豐度蛋白質遮蔽問題可通過采用窄pH梯度膠條與預分級相結合的方法或者用親和色譜去除極高豐度蛋白質方法來解決［10］。極酸和極堿蛋白分離可通過采用偏酸和偏堿性pH梯度膠條結合預分級方法來提高其分辨率［13］。

1.2.2 雙向熒光差異凝膠電泳 針對2-DE重復性較差的問題，Unlu等［14］開發出雙向熒光差異凝膠電泳技術（Two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis，2D-DIGE）。其原理是將3種來源不同的蛋白質分別用不同CyDyeTM熒光染料標記，混合后進行2-DE，并用相應激發波長來檢測被不同熒光基團所標記的蛋白，配合全自動蛋白質表達分析軟件精確分析測定不同蛋白質組之間的差異蛋白表達。這種方法克服了普通雙向電泳技術的一些瓶頸，能夠提高2-DE重復性和定量的精確度，還有助于2-DE整合到蛋白質組的自動化流程中去。目前，DIGE技術主要用于功能蛋白質組學，如對各種癌癥的研究，尋找致病分子標記物，探究癌變引起的蛋白質變化等［15］。缺點是DIGE技術非常靈敏，目前許多質譜儀還沒有足夠的靈敏度來鑒定其分離出的蛋白質，且所用試劑非常昂貴，使之難于得到廣泛應用。

1.2.3 同位素相對標記與絕對定量技術 如何系統地識別和定量一個蛋白質組是當今蛋白質組學研究的一個主要目的，因為蛋白質濃度對于其功能實現有著非常重要的作用［16］。美國應用生物系統公司在2004年推出一項新的體外同位素標記技術——相對和絕對定量同位素標記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術［17］。iTRAQ 技術使用8 種（或4 種）不同的同位素試劑來同時標記和比較8 種（或4 種）不同蛋白質樣品［18］。iTRAQ技術已成為目前蛋白質組學定量方法中一項重要技術，其作用已經在許多生物體和組織研究中得到證明［19，20］。但iTRAQ 試劑容易受樣本中雜質蛋白及處理過程中緩沖液的污染。此外，目前iTRAQ試劑仍非常昂貴，這在一定程度制約了它的廣泛應用。

1.2.4 質譜技術 與傳統的蛋白質鑒定方法相比，質譜分析技術具有靈敏、準確、高通量、自動化等特點成為當前蛋白質組學技術的支柱［21］。質譜鑒定蛋白質的基本原理是使樣品分子離子化，然后根據不同離子間的質荷比（m/z）差異來分離并確定蛋白質相對分子質量［22］。質量分析方式和電離方式的不同組合形成了不同類型質譜。常見的離子化方式有電噴霧電離（ESI）和基質輔助激光吸附電離（MALDI）。質量分析方式有離子阱、傅立葉交換離子回旋共振、飛行時間和四極桿分析。四種質量分析方式可獨立使用，也可串聯使用。例如，MALDI常常和TOF組合，來測定肽段質量。近年來，MALDI也和兩個TOF聯用［23］。質譜技術可用于磷酸化、糖苷化及其它蛋白質的修飾化研究［24］。

2 木薯育種中存在的問題

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Miller）植物，為世界3大薯類作物之一，塊根淀粉含量20％-40％［25］，有“地下糧倉和淀粉王”美稱［26］。木薯原產熱帶南美地區，有4 000多年的栽培歷史；木薯是19世紀20年代由東南亞愛國華僑開始引入我國，首先在廣東省高州市栽培，隨后傳入海南島并遍及華南地區，至今有200多年的栽培歷史。在我國木薯廣泛分布于廣西、廣東、云南、海南、福建和江西等華南省區，長江流域一些地區也有種植［27］。木薯既是我國南部地區重要的淀粉工業和生物質能源原料，也是熱帶地區潛在的糧食安全有效補充。2015年9月17-18日國家木薯產業技術體系組織召開“中國木薯栽培技術發展戰略研討會”，與會木薯育種學家根據目前市場和木薯產業發展需求提出我國“十三五”木薯育種任務，即選育的品種除了含有高產穩產特性外［26］，還要具備以下某方面的特征：（1）薯型粗短、結薯集中、易機械化收獲品種；（2）矮化密植綜合抗逆性強品種；（3）富含蛋白質和類胡蘿卜素及食用風味好的品種；（4）早熟抗寒北移品種。然而木薯遺傳背景復雜，全基因組高度雜合，后代性狀分離嚴重，還具有自交不親和、種子數量少等特性，導致雜交選育種效率低下［25，26］等問題。因此，僅依靠傳統的雜交育種手段很難實現上述的“十三五”育種目標［28-31］。近年來，利用高通量測序技術（Roche/454 或 Solexa）開展野生木薯近緣種M. esculenta ssp. flabellifolia（W14）與栽培品種M.esculenta ssp. esculenta（KU50）比較基因組學研究，完成了W14和KU50的全基因組草圖，證實了木薯基因組的高雜合度，分別發現野生祖先種和栽培種的34 483和38 845個基因。注釋了碳流、淀粉積累和氫氰酸合成代謝通路關鍵基因的生物學功能，并開發出數百萬個全基因組分子標記［32］。但通過這些全基因組數據只能間接告訴我們蛋白質的功能，因為從基因表達的mRNA水平到最終合成蛋白質水平，這其中包含著蛋白質翻譯的調控、糖基化、磷酸化等諸多因素，這些因素都有可能改變作為直接作用因子的蛋白質功能，因而直接研究蛋白質變化具有不可替代的意義，它們幾乎負責細胞所有的生物化學活性。而采用蛋白質組學技術分析木薯不同種質及其亞細胞結構或不同生長時期的蛋白質組，通過解析它們的生物學功能、廣泛而完整的認識蛋白質調控網絡，發掘重要蛋白質群在代謝通路的協同調控機制，為蛋白質組學在木薯育種的應用提供了重要平臺。

3 蛋白質組學在木薯育種中的應用

由于蛋白質組學能從全蛋白質角度提供植物細胞、組織或整株植物對環境脅迫的各種響應信息［33］，因此蛋白質組學技術在農業科學研究中得到廣泛的應用。例如，分析水稻不育花粉［34］、小麥T 型細胞質雄性不育系［35］和矮桿大豆［36］的蛋白質組，揭示出與雄性不育或矮桿突變體相關的關鍵蛋白質群體，有助于從蛋白質角度了解雄性不育和矮桿相關蛋白質的生物學功能。通過研究植物對生物和非生物脅迫，如病蟲害脅迫［37，38］、鹽脅迫［33］、缺氧脅迫［39］和熱脅迫［40］等的蛋白質組學，對農作物品質和產量改良有一定積極作用。目前蛋白質組學研究已經深入到亞細胞水平，亞細胞蛋白質組就是利用蛋白質組學技術來分析一種組織或細胞的某一亞細胞結構的蛋白質組成，它一方面降低樣品復雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應亞細胞結構的低豐度蛋白質。Chen等［13，41］運用2-DE結合LCESI-MS/MS對細胞核、染色質和細胞骨架的蛋白質組進行全面分析，確定了30多種關鍵蛋白質在這3種亞細胞結構中的定位和功能，對揭示蛋白質的定位和功能信息具有重要價值。農作物亞細胞研究比較多的是葉綠體［42，43］和線粒體［44，45］蛋白質組，提供了功能基因組學的有用信息以及與這些組分生物發生相關的新組分鑒定等。本研究綜述當前木薯蛋白質組學的研究成果，探討蛋白質組學在木薯育種中的應用。

3.1 蛋白質組學在選育高光效和高淀粉積累種質中的應用

木薯鮮薯產量依靠塊根淀粉的高效積累，而塊根淀粉主要來源于光合作用同化物的高效轉化。源（葉）是光合產物的生產和供應者，源是庫（塊根）的基礎，庫是光合產物積累、需求、消耗的器官，因此解析源、流、庫的調控機制對挖掘木薯的產量潛力具有重要作用。陳霆［46］以不結薯的野生木薯（M. glaziovii）、結薯但產量很低的野生木薯近緣種W14和高產高淀粉木薯栽培種華南205（M. esculenta cv. SC 205）為研究材料，利用表達蛋白質組學技術對3種木薯功能葉片蛋白質組進行比較研究，同時結合葉片的組織結構、葉綠素含量及葉綠素熒光參數日變化數據，探討木薯栽培種葉片高光效的分子機制。3種木薯葉片葉綠素熒光參數ΦPSⅡ日變化均呈先上升后下降的趨勢，在上午11時均達到最大值，此時的凈光合速率也均達到最大值，且栽培種SC205顯著高于野生木薯和W14；根據蛋白質組學分析數據發現木薯栽培種SC205葉片中磷酸激酶等能量代謝、Rubisco、RCA等光合作用及淀粉合成相關的蛋白質群高水平表達，作為一種信號轉導分子14-3-3蛋白質在栽培種SC205也上調表達，推測其可能參與源、流、庫代謝通路的信號轉導，從而提高栽培種SC205葉片的光合效率；通過Western blot分析參與光合作用通路的關鍵蛋白質，如Rubisco、PEPC、D1及OEC等的表達水平，也驗證了這一結果，這些研究可為高光效、高產、高淀粉木薯新品種的選育提供理論參考。為進一步解析木薯塊根淀粉積累的分子機理，中國熱科院陳松筆研究團隊通過采用雙向電泳結合MALDI-TOF-MS方法測定野生木薯近緣種W14和高產高淀粉栽培種SC205及華南8號（SC8）塊根蛋白質組發現，塊根共有蛋白質103個，野生種特有蛋白質58個，栽培種特有蛋白質87個；從這些特有蛋白質中有可能篩選出高產木薯種質的標記蛋白質。宋紅艷［47］以野生木薯M. glaziovii為對照，開展W14和SC205 塊根淀粉合成和分解代謝通路的轉錄組研究。結果顯示栽培種SC205和W14相比，與淀粉合成通路相關的蛋白酶活力提高，與淀粉降解相關的蛋白酶活力降低，研究結果從轉錄組水平支持了木薯栽培種SC205塊根淀粉高積累的分子機制。

3.2 蛋白質組學在選育高蛋白質和高類胡蘿卜素食用種質中的應用

木薯塊根沒有蛋白質體，缺少貯存蛋白質的功能［48］，這是木薯塊根蛋白質含量（0.7％-2.5％，DW）普遍低于谷類作物（7％-14％，DW）的原因；許多長期以木薯塊根為食的非洲國家，由于蛋白質營養不良表現出嬰幼兒、兒童及青少年生長發育遲緩、消瘦、智力發育障礙和成人易疲倦、貧血、免疫功能下降、生殖功能障礙等征狀。巴西國家農牧研究院Carvalho教授團隊通過光學顯微技術觀察木薯不同種質的塊根，發現蛋白質含量低的白心木薯塊根（蛋白質含量為0.955％，DW）有色體數量少，而深黃木薯塊根（蛋白質含量為6.12％，DW）的有色體數量是白心木薯的5倍以上；推測木薯蛋白質含量可能與有色體數量相關。木薯有色體是類胡蘿卜素的載體，普通木薯類胡蘿卜素含量低（2.4mg/g FW）［49］。Ceballos 等［49］和 Sánchez 等［50］利 用 雜交育種方法從2148份種質中篩選出高類胡蘿卜素達25.8mg/g FW的種質，與含量最低的種質類胡蘿卜素含量相差258倍。為解析類胡蘿卜素在木薯有色體的高積累與有色體是否作為蛋白質積累的載體，可采用亞細胞蛋白質組對木薯塊根有色體蛋白質進行全面分析，使蛋白質定位和鑒定變得更簡單、快捷、準確和高效。如Carvalho 等［51］通過空間排阻色譜法（Size exclusion chromatography）從深黃木薯塊根有色體分離出與類胡蘿卜結合蛋白質及類胡蘿卜非結合蛋白質兩部分，然后采用LC-MS/MS質譜法鑒定蛋白質發現，與類胡蘿卜結合蛋白質有83個，與類胡蘿卜非結合蛋白質106個，其中超過一半以上的蛋白質都是HSP。類胡蘿卜素的生物合成多種多樣，是一個高度調控的過程。在光合作用組織里，類胡蘿卜素積累在葉綠體膜上，而在非光合作用組織里，類胡蘿卜素在有色體中積累。有色體是由白色體或葉綠體轉變而來，有色體也能轉變為葉綠體［52］，研究表明Or基因能夠調控有色體分化和有色體-葉綠體之間的轉變，Or 基因編碼的蛋白質為 DnaJ-like cochaperone。DnaJ蛋白質的作用是與HSP70伴侶相互作用，共同進行蛋白質的折疊、組裝，拆卸和易位［53］。Or基因不直接調控類胡蘿卜素的合作，通過顯微結構的分析發現Or 基因在植物原本不積累色素的部位引起白色體或淀粉體向有色體轉變，成為類胡蘿卜素貯存庫，從而在不影響正常類胡蘿卜素代謝通路的前提下促進類胡蘿卜素積累［54］。Fibrillin蛋白質具有穩定蛋白質結構的功能［55］，在許多植物中均有發現，尤其在類胡蘿卜素儲存纖維型有色體中。通過利用亞細胞蛋白質組學方法，Carvalho等［51］發現 Fibrillin 和 Or 蛋白質位置是在類胡蘿卜非結合蛋白質區域，表明這兩個蛋白質間接參與類胡蘿卜素積累的代謝通路，該報道驗證了上述研究結果。Carvalho等［51］的亞細胞蛋白質組學研究還第一次揭示在有色體中與木薯塊根蛋白質積累通路偶聯的5個蛋白質，即HSP18.1，HSP21，HSP17.4，HSP17.6和 Or蛋白質，這些蛋白質的表達水平可作為衡量木薯塊根蛋白質高積累的標記。通過亞細胞蛋白質組學研究還可以解析有色體類胡蘿卜素積累與蛋白質含量偶聯的主要環節［56］。因為木薯塊根的白色體主要是淀粉體，當淀粉體向有色體轉變后，為類胡蘿卜的合成和積累提供了場所和載體，保證有色體結構穩定和功能發揮以及類胡蘿卜素積累的持續，導致一系列蛋白質參與促成這些代謝過程的穩定運行，因而從總體上提高了蛋白質的含量。所以淀粉體向有色體轉變的調控機制是提高木薯種質蛋白質積累的關鍵，這些研究結果為選育高蛋白質木薯種質提供了新思路［57］。

3.3 蛋白質組學在選育抗逆木薯種質中的應用

木薯為二倍體植株，染色體數為36［58］，其可利用莖稈作為種莖進行無性繁殖；通過人工誘變可獲得多倍體，如利用秋水仙素誘導木薯腋芽，獲得一系列木薯多倍體，增加遺傳進化的多樣化。多倍體育種不受開花授粉時間和氣候環境的限制，靈活性較大［59］。木薯染色體加倍后，表型常表現出器官增大、性成熟晚及抗性增強等特點［60］。利用蛋白質組學方法研究多倍體，可從全蛋白質角度解析木薯多倍體抗性提高的分子機理。研究發現木薯NZ199四倍體參與光合作用、碳代謝與能量代謝及防御體系的蛋白質群表達水平均上調，說明NZ199四倍體的光合效率與抗逆性均顯著高于其二倍體；通過分析四倍體和二倍體功能葉片葉綠素熒光參數ΦPSⅡ的變化及它們對鹽脅迫的反應，驗證了上述蛋白質組的研究結果［61，62］。為進一步從分子水平揭示多倍體對產量的影響，安飛飛等［63，64］利用蛋白質學方法研究SC8二倍體和四倍體功能葉片及塊根的蛋白質組，發現四倍體葉片參與光合作用的相關蛋白質表達上調，而塊根中參與淀粉合成的部分蛋白表達下調，說明四倍體光合效率較二倍體顯著提高［63］，但鮮薯產量下降［64］；四倍體和二倍體葉片葉綠素熒光參數ΦPSⅡ變化及鮮薯產量分析結果支持上述蛋白質組學的研究報道；這些分析結果從分子水平為木薯多倍體種質的改良提供理論參考。

木薯為熱帶作物，對低溫敏感。為促進木薯的北移，擴大我國木薯種植面積，滿足淀粉生產企業對木薯原料的需求，選育耐低溫木薯品種是國家木薯產業技術體系“十三五”的育種目標之一。通過利用蛋白質組學技術研究在5℃低溫脅迫15 d木薯的葉片生理生化特性變化及其蛋白質組，發現低溫脅迫后，葉片中參與光合作用、碳水化合物與能量代謝、蛋白質合成及生物防御等多個代謝通路的蛋白質群表達水平發生顯著變化［65］。由于木薯在每年3-4月分經常遇到干旱，為從分子水平了解木薯對干旱的蛋白質響應機制，徐娟［66］利用蛋白質組學方法研究耐旱木薯品種華南124在干旱脅迫下葉片的蛋白質組，發現其葉片中參與光合作用、能量代謝及防御系統的蛋白質群表達水平上調，說明該品種抗旱能力較強，可在較為干旱地區推廣種植；利用上述研究結果篩選出一批耐寒及耐旱木薯種質。

Li等［67］研究木薯SC8不同組織的蛋白質組，表明木薯塊根含有102個特異蛋白質，它們在木薯組織、器官和細胞的生長發育過程中行使不同的生物學功能，塊根不僅作為儲藏營養的器官，還參與了大部分的生理代謝活動。但塊根不耐貯藏［68］，在收獲72h內快速出現采后變質，這種快速變質過程與收獲過程中不可避免的機械損傷有關［69］，因此耐貯性一直是國際上木薯研究的熱點［70］；木薯若保質期延長到幾周，僅尼日利亞在20年間將會減少經濟損失29億美元［71］。通過研究國內兩個主栽木薯品種在塊根貯藏中的差異蛋白質組，發現信號轉導、抗氧脅迫相關的蛋白質在貯藏過程中均有不同程度的變化，尤其是鈣調素蛋白質（CaM），其在采收貯藏24h和72h后的表達量均出現明顯上調。Ca2+作為信號分子是木薯塊根采后腐爛調節的關鍵，Ca2+-CaM復合物體系的網絡樞紐可能在調控整個木薯塊根采后生理代謝中起著重要作用［72］。研究還發現塊根皮層與薯肉的差異表達蛋白質分別參與碳水化合物和能量代謝、解毒、信號傳導、蛋白質合成等代謝途徑，而且木薯塊根皮層相關蛋白質還具有構建防御系統及對薯肉起保護作用的功能，在貯存過程中其蛋白質降解較快，推測這些蛋白質也是塊根延長貯存的關鍵調控蛋白質［73］。目前，正在進一步對CaM在采后腐爛過程中的生物學功能進行驗證。

4 展望

蛋白質組學研究技術已廣泛應用于生命科學研究的各個領域，如應用于鑒定參與防御和應激反應以及在改進作物突變體中的關鍵蛋白質群等。本研究從選育高光效、高淀粉積累、高蛋白質和高類胡蘿卜素及高抗逆種質方面闡述蛋白質組學在木薯育種中的應用。隨著木薯全基因組測序和組裝工作的完成及基因組數據庫的構建［32］，蛋白質組學的研究技術在木薯育種中的應用將會變得越來越重要。利用木薯全基因組草圖和基因組數據庫平臺，可推測蛋白質的氨基酸組成和結構；利用蛋白質的保守結構域來推測該蛋白質在不同代謝通路的生物學功能及其相互作用關系，從而驗證和闡明蛋白質在其調控網絡中的重要生物學功能，建立木薯選育高光效、高淀粉積累、高蛋白和高類胡蘿卜素及抗花葉和褐條病毒病種質的蛋白質生物調控網絡，來創制具有優良特色的突變體，實現蛋白質組學對輔助木薯選育種中的重要作用。為了更好地解決木薯選育種中面臨的挑戰，進一步提高木薯選育種效率，除了依托木薯基因組學研究平臺外，有必要在以下三個方面進行系統和深入開展蛋白質組學的研究。（1）強調多學科交叉研究，構建木薯綜合大數據庫：結合栽培生理、基因組、轉錄組、代謝組及系統生物學進行深入研究，從生理表象、基因轉錄、蛋白質翻譯和修飾、主要代謝產物和次級代謝產物層面深入分析木薯表現型和基因型的關系，篩選出調控木薯產量性狀和抗性等相關農藝性狀的關鍵基因及重要蛋白質，并進行功能驗證，為加快木薯選育種進程提供綜合大數據庫。（2）加強蛋白質相互作用研究：將鑒定到與木薯不同生理代謝通路相關的重要蛋白質群制作成蛋白質芯片，結合酵母雙雜交和表面等離子共振技術等，高通量研究蛋白質-蛋白質、蛋白質-RNA及蛋白質-小分子等的相互作用，揭示木薯不同突變體生長發育、分化凋亡以及其生物調控機制等生命活動規律。（3）加深研究與代謝活動相關的蛋白質翻譯后修飾機制：蛋白質翻譯后修飾與蛋白質生物學功能密切相關，如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化等，分析這些蛋白質修飾與信號傳導、細胞凋亡以及逆境脅迫生理代謝通路的相關性，為木薯選育種中開發與性狀相關的標記蛋白質及更好地揭示其在生理代謝中的作用機理奠定堅實基礎。

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