無脊椎動物DNA甲基化研究進展

柳瑩 唐永政 高麗

（煙臺大學海洋學院，煙臺　264005）

無脊椎動物DNA甲基化研究進展

柳瑩 唐永政 高麗

（煙臺大學海洋學院，煙臺264005）

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機制，可在不改變DNA序列的基礎上改變細胞的轉錄物組并造成表型上的差異。在不同進化分支中，DNA甲基化狀態有很大的不同，無脊椎動物DNA甲基化多發生于轉錄區域并與基因表達高度相關。研究表明，DNA甲基化對于社會性昆蟲的等級分化具有重要影響，并且可以通過啟動子識別、外顯子遺漏等機制來增加轉錄變異體的數量，從而提高表型的靈活性，增加生物體應對環境變化的能力。對無脊椎動物DNA甲基化的機制及功能進行綜述，旨在為相關研究提供參考，并對未來的研究方向作出展望。

DNA甲基化；基因體甲基化；轉錄物組

DNA甲基化是一種進化上保守且具有重要生物學功能的表觀遺傳機制［1］。在不改變DNA序列的基礎上，通過將甲基添加到DNA分子上，可以對生物體的遺傳表達進行調控。DNA甲基化會導致染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，進而對基因的表達產生影響。

在基因組內，DNA甲基化狀態可分為暫時性的和永久性的兩種。環境的變化可導致基因甲基化狀態的改變，進而對細胞的轉錄物組（Transcriptome）產生影響，因此，即使是基因型完全相同的個體，也會產生表型上的差異，就像在同卵雙胞胎中出現的情況。在不同的生物門類中，DNA甲基化的狀態有很大的不同。無脊椎動物通常表現出基因組內不均一的甲基化狀態，甲基化多發生于轉錄區域，這一模式因此也被稱為基因體甲基化（Gene body methylation，GBM）［2］。生物全基因組范圍內的甲基核苷酸也可被稱為生物的甲基化組（Methylome）。

迄今為止，關于DNA甲基化的研究多數來自醫學領域，特別是人類疾病相關基因的甲基化情況，但是關于無脊椎動物基因組水平的甲基化研究還是比較少。相關的研究主要集中于以下領域：意大利蜜蜂（Apis mellifera）的等級分化，家蠶（Bombyx mori）的絲腺表達，太平洋牡蠣（ Crassostrea gigas）的適應機制，佛羅里達弓背蟻（Camponotus florida-nus）和印度跳蟻（Harpegnathos saltator）的進化歷程，造紙胡蜂（Polistes dominula）及麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的發育調控等。本文將主要對這幾種生物中發現的DNA甲基化模式及相關功能進行綜述。

1 DNA甲基化的模式

1.1 DNA甲基化機制

據推測DNA甲基化進化自原始細菌的限制-修飾系統，由原始的免疫功能發展為基因表達調控功能［3］。在細胞中，DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化完成。DNMTs可依據活性的不同進行分類，在哺乳動物中，DNMTs的作用可分為初始合成（de novo）和維系現狀（Maintenance）兩類［4］。具初始合成功能的DNA甲基化酶類以 DNMT3蛋白質家族為代表，負責基因組中新的甲基化模式的產生，而具維系現狀功能的DNA甲基化酶類以 DNMT1蛋白質家族為代表，負責復制過程中已有甲基化模式的維系。DNMT2蛋白質家族起先也被認為是催化DNA甲基化的酶類，但是最近的研究表明其作用是對tRNA 進行甲基化［5］。因此，在生物體內，通常認為DNMT1與 DNMT3的共同存在標志著甲基化系統的正常運轉。但也有例外，如在家蠶的體內，雖然只有DNMT1而沒有DNMT3的存在，但是卻表現出與蜜蜂基因組相似的甲基化水平（0.7% vs 0.5%）［1］。

除此之外，甲基化CpG結合蛋白（Methyl-CpG-binding domain proteins，MBDs）也可以特異性地結合甲基化的CpG并在不同水平發揮表觀遺傳調控作用。在哺乳動物中，MBD中包含有一個甲基化CpG識別結構域，因此可以特異性地結合甲基化的DNA，并可將染色質重塑因子定位到DNA甲基化的區域，進而對表觀遺傳調控產生影響［6］。但在無脊椎動物中，相關的作用細節仍然尚待明確。

1.2 DNA甲基化位點

在原核生物中，甲基化多發生于腺嘌呤位點，而在真核生物中，絕大多數的甲基化位點是胞嘧啶［7］。在動物界中，胞嘧啶的甲基化多發生于CpG二核苷酸序列之中，而在植物界和真菌界，在CHG或CHH序列中也可發現甲基化的胞嘧啶［8］。在植物中，DNA甲基化多發生于重復序列或轉座子區域，甲基化核苷酸類似于“鉚釘”將轉座子釘住，以抑制其轉移活性［9］，但在無脊椎動物中，DNA甲基化主要發生于基因內部，基因間區大部分未被甲基化，重復序列或轉座子區域的甲基化情況在昆蟲中幾乎不存在［10］。在無脊椎動物中，外顯子和內含子的甲基化模式也表現出較大差異，如在牡蠣中，外顯子和內含子存在較高的甲基化水平［11］，而在金小蜂中，內含子的甲基化水平卻要顯著低于外顯子［12］。

有些生物基因組的甲基化位點展現出高度的特異性，如桃蚜（Myzus persicae）的基因組雖然整體來說缺乏甲基化修飾。但是在其解毒酶的編碼區卻存在有CpG甲基化的情況，其中胞嘧啶甲基化的缺失將導致基因的沉默，進而引起昆蟲抗藥性的缺失［13］。對于另一種蚜蟲，麥二叉蚜（Schizaphis graminum）的研究也得出了類似的結論［14］。

基因組水平的研究顯示了無脊椎動物不同轉錄單元之間甲基化水平的巨大差異，有些轉錄單元被高度甲基化而另一些則具有極其低度的甲基化水平［15］。甲基化與轉錄水平之間的關系也展現出了種間特異性，在海葵（Nematostella vectensis）和家蠶中的研究都表明，基因的甲基化水平與表達產物mRNA的水平之間存在有正相關［1，16］。但是在對蜜蜂中的研究顯示，表達最為頻繁和表達最不頻繁的基因都被甲基化了［1］。因此，對相關遺傳及進化機制的了解仍有賴于對于生殖細胞系及體細胞甲基化圖譜的深入研究。

1.3 DNA甲基化水平

在脊椎動物中，基因組的甲基化水平整體較高，CpG二核苷酸中大約70%-80%的C被甲基化，而無脊椎動物基因組的甲基化水平通常較低，兩種重要的模式生物，果蠅（Drosophila melanogaster）和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）均缺乏DNA甲基化的情況［17］。對家蠶絲腺甲基化譜的研究發現，大約0.11%的基因組胞嘧啶被甲基化修飾，比哺乳動物和植物低至少50倍［16］。通常，DNA甲基化的情況分布于整個基因組中，但是在基因的5'末端，DNA甲基化程度較低且出現了兩種不同的分布模式。在組織特異性表達基因的啟動子區域，CpG含量較低但甲基化水平較高。而在持續表達的持家基因的啟動子區域，CpG含量較高，甲基化水平較低［18］。

由于技術手段的有限和工作量的巨大，在實際研究中很難對生物整個基因組進行DNA甲基化測定，相關數據多來自對相關序列進行的計算機推斷分析（in silico）的結果。例如，甲基化的胞嘧啶可以自發性地脫氨形成胸腺嘧啶，這一突變很難被DNA修復機制識別糾正，隨著時間的推移，基因組中的CpG序列會逐漸消失。因此序列之中較低的CpG水平就暗示了甲基化過程的存在，通過比較CpG的實際存在水平與期望水平（Observed to expected CpG contents，CpG O/E ratio），我們可以對甲基化的進程有所了解［19］，這一過程又被稱為標準化CpG含量分析（Normalized CpG content analysis）［20］。對于蜜蜂基因組不同區域的標準化CpG含量分析表明，有些基因經歷了廣泛的脫氨過程因而是甲基化作用的主要位點［21］，這一研究結果其后也得到了其他DNA甲基化功能相關研究的證實［1，16，17，22］。在人虱（Pediculus humanus）中同樣出現了只存在DNMT1而不存在DNMT3的情況，但是對于基因組標準化CpG含量的分析卻暗示了甲基化過程的存在［20］。

2 DNA甲基化的功能

2.1 DNA甲基化與轉錄模式

基因不同的甲基化模式對應的是轉錄水平及功能的不同。在昆蟲中，高度甲基化的基因通常具有持家功能并得到了高效表達［23］，而低度甲基化的基因則可能執行的是可誘導的調節功能如細胞信號傳導或環境刺激性反應［24］。在社會型昆蟲中，環境誘導性的甲基化導致了不同等級相關表型的出現。在蜜蜂中，蜂王漿能通過DNA甲基化作用來修飾蜜蜂的基因組，并干擾使幼蟲變為工蜂的基因的表達［25］。對同一蜂巢中不同分工的蜜蜂如采蜜蜂和保育蜂而言，其負責調控基因表達的DNA甲基化模式也存在有差異。當研究人員采取手段誘使采蜜蜂轉化為保育蜂時，其甲基化模式也會隨之發生相應改變［26］。對于較為原始的社會性昆蟲造紙胡蜂的研究也表明，其基因組內存在有與等級分化相關的位點特異性甲基化DNA［27］。

對于不同社會等級和發育階段的佛羅里達弓背蟻和印度跳蟻的DNA甲基化研究表明，雖然這兩種螞蟻在1億多年以前就已經分化，但某些與等級分化及發育變化相關的差異甲基化基因在這兩種不同的螞蟻中是保守的，包括與繁殖、端粒維持及非編碼RNA代謝調控相關的一些基因［28］。在對濕木白蟻（Zootermopsis nevadensis）進行基因組測序后，也發現了DNA甲基化模式和可變剪切對其社會化分工的表觀遺傳控制作用［29］。因此，DNA甲基化對于維系社會性昆蟲的基因等級差異性表達具有非常重要的功能，而相對于非甲基化的基因而言，甲基化的基因在其功能的維系上也具有更高的保守性。

2.2 DNA甲基化與啟動子識別（Promoter recognition）

在脊椎動物的基因啟動子區，CpG甲基化的情況較少出現。在哺乳動物中的研究表明，有些特定轉錄因子對其結合位點的DNA甲基化非常敏感，在這種情況下，即使是在C+G含量少的區域，啟動子、增強子等基因調控區的甲基化也會阻止轉錄因子結合，從而抑制基因的表達［30］。例如，對于海兔（Aplysia）的研究表明，CREB2基因啟動子區的CpG島甲基化將抑制基因的表達，從而影響到記憶相關突觸的可塑性調控［31］。在轉錄過程中，組織特異性的甲基化通常會降低轉錄延伸的效率，但在某些特殊的情況下，也可增強轉錄的效率［32］。

在牡蠣基因組中，DNA的甲基化會導致與之結合的轉錄因子的改變，進而增加轉錄變異體（Transcript variants）的數量［33］，因為牡蠣生活在環境高度多變的潮間帶，其環境溫度及鹽度在不同潮位和季節會產生很大的變化，而牡蠣一般附著在淺海物體和礁石上，不能夠通過主動移動來逃避不利環境的影響，因此必須具有一套遺傳機制使其對溫度、鹽度、干露、重金屬和海區常見病原等具有很強的抵抗力，而甲基化可以使其有限的基因更為靈活地應對環境的變化。與其他無脊椎動物門類相比，牡蠣基因組中胞嘧啶甲基化程度較高為2%（昆蟲中為0.15%）［1，11］，而對于牡蠣生殖系細胞的研究表明，在配子發生的過程中，雌雄配子間及配子的不同發育階段甲基化模式均展現出一定的差異［34］，在牡蠣成體腮細胞的單堿基分辨率甲基化組圖譜中也發現了啟動子區域的甲基化狀況［11］。因此，DNA甲基化對于牡蠣早期發育階段的細胞分化有重要影響，還可通過增加轉錄變異體的數量來提高表型的靈活性，增加生物體應對環境變化的能力。

2.3 DNA甲基化與外顯子遺漏（Exon skipping）

在測序基礎上對高分辨率甲基化組進行分析，可以看到外顯子和內含子之間也存在著甲基化差異，暗示著DNA甲基化可能參與了調控剪切［30］。研究表明，在蜜蜂中，DNA甲基化主要集中在外顯子區域，而多數轉錄物也來自于甲基化的基因，這可能是因為甲基化的外顯子在可變剪接過程中起到了積極作用而導致的結果［35］。外顯子DNA甲基化的差異可能與可變剪切相關，如外顯子遺漏以及剪切位點的選擇，從而影響到基因表達［28］。對于蜜蜂的研究表明，在蜂后和工蜂中單個基因GB18602由于甲基化模式不同而出現了差異性表達，此基因有一長一短兩種不同的轉錄物，在較長的轉錄物中缺失了一個包含終止密碼子的外顯子，DNA甲基化與外顯子遺漏展現出密切的關系［22］。螞蟻的DNA甲基化也多發生在活躍轉錄的外顯子區域，特別是基因的第二個外顯子上。在哺乳動物中，DNA甲基化對外顯子遺漏與可變剪接（Alternative splicing）的影響也已得到證實［36］。

但是，DNA甲基化并非外顯子遺漏的必要條件，在金小蜂基因組中，甲基化與非甲基化基因在可變剪接水平上并無明顯的差異［12］。因此，外顯子選擇與甲基化之間的關系還在進一步的研究過程當中。

3 DNA甲基化與進化

3.1 DNA甲基化與表型特征

在無脊椎動物中DNA甲基化展現出兩種不同的模式：高甲基化水平和低甲基化水平的基因在進化機制上表現出明顯的差異。在基因表達過程中，DNA甲基化執行的多是“微調”而非“開關”功能。因為基因表達是一個整體上趨于隨機的事件，而DNA甲基化將導致其動態過程中的偏差。在生物體中，DNA甲基化與表型特征之間的關系取決于年齡、性別等多個因素。在不同的發育階段，不僅是甲基化的基因類型不同，甚至同一個基因的不同區域也可出現差異。因此，DNA甲基化會對細胞的轉錄物組（Transcriptome）產生影響，進而影響生物的表型［37］。例如，三倍體牡蠣通常是不育的，但是種群中的少數個體（“alpha”三倍體）卻可以產生成熟的配子體［38］，而這些個體的甲基化狀態與種群中其他不育的三倍體不同，卻與可育的二倍體相似［39］。

在蜜蜂生殖細胞系中，廣泛表達的基因被甲基化而等級特異性基因則缺乏甲基化，因此等級特異性基因可能具有更高的表型遺傳靈活性，可以通過暫時的甲基化與去甲基化來調控其表達過程［21］。在金小蜂中，甲基化的基因在各個發育階段都獲得了組成性表達，而非甲基化基因則展現出更為動態的表達模式［12］。

3.2 DNA甲基化與基因組進化

通過不同生物基因組的比對發現，高度甲基化的基因通常具有較低的遺傳多樣性水平與較多的直系同源基因（Ortholog）［23］，在金小蜂中的研究還表明，在缺乏生殖系甲基化的基因中，出現了較高的遺傳多樣性水平［40］。這是非常令人驚訝的一點，因為甲基胞嘧啶具有高突變性，所以長時間的進化應該會導致同源基因間較大差異的產生。但是因為CpG含量較低的基因中胞嘧啶導致的突變率也較低，而CpG含量較高的基因通常功能上比較重要，因此較強的選擇壓力導致了進化上保守性的產生［24］。

性成熟的個體可以用甲基化標記生殖細胞系，進而將甲基化組傳遞給后代。如果這一過程持續發生，將會導致整個基因組的進化改變［34］。研究表明，與有性繁殖的陸地植物及動物不同，無性生殖的單細胞動物和真菌很少或沒有DNA的甲基化情況［1］。盡管甲基化是一種古老的進化機制，而且毫無疑問會增加基因突變的幾率，但是在有性生殖的生物中，它仍然在基因組進化中發揮重要的作用。比較基因組學的研究表明，在經歷了1.9億年的分支進化后，蜜蜂和金小蜂的同源基因仍然展現出高度相似的甲基化水平［40］。此外，減數分裂過程中的基因轉換（Gene conversion）事件也會導致基因組中CpG含量的升高［21，41］，不同物種基因組中CpG水平的維系可能是不同進化歷程下不同選擇壓力造成的結果。

4 展望

1975年，Riggs和Holliday等［42，43］首次提出甲基化胞嘧啶可以在真核生物基因表達和細胞分化中發揮特定的作用。隨著DNA甲基化研究范圍的擴大，甲基化與基因表達的復雜的關系逐漸被揭露出來。2009年，借助于功能強大的計算機和新一代測序技術，兩種人類細胞的全部表觀基因組圖譜得以繪制，它們分別是胚胎干細胞和肺部纖維原細胞［44］。近年來，由于高通量表觀基因組繪圖技術的快速發展，已生成了成千上萬的甲基化圖譜，對這些圖譜的解讀也日益深入。

但是，問題總是與發現伴隨而來。目前，在測序基礎上可以對高分辨率甲基化組進行分析，但這樣的技術生成的是DNA甲基化的靜態圖譜，而無法展示甲基化穩定性隨時間推移的變化。研究顯示，有些轉錄因子的結合發生在DNA甲基化改變之前，這說明DNA甲基化的許多改變是基因調控的產物而非其原因。因此，要正確解讀甲基化圖譜，必須將指導基因調控的甲基化與轉錄因子結合所造成的甲基化區分開來［30］。

在哺乳動物中進行的研究表明，相似的DNA甲基化狀態可能導致不同的基因表達結果。是什么導致了不同生物基因組內的甲基化模式；甲基化是控制著轉錄過程，還是僅僅反映了轉錄狀態；因為不同物種間DNA甲基化的分布模式存在有巨大差異，這是否意味著其功能上也具有多樣性；在對生物基因組的大規模編程中，甲基化模式具有什么樣的含義。雖然基因體（Gene body）是真核生物進化上最保守的DNA甲基化靶，但是，基因體DNA甲基化的調控功能在很大程度上仍然是未知的。

除此之外，在脊椎動物中，DNA甲基化相關蛋白質也參與了組蛋白修飾及染色質重塑的過程［45］，但是DNA甲基化與其他表觀遺傳機制之間的相互作用尚待深入研究。來自不同物種不同組織的甲基化圖譜與轉錄組信息將有助于我們了解甲基化與轉錄調控之間的復雜關系。另一個在哺乳動物中的重要發現是DNA甲基化可能在基因組印記（Genomic imprinting）中起到一定的作用，從而導致帶有親代印記的等位基因的不同表達特性［46］，而對于社會型昆蟲（如蜜蜂）的研究將使我們對于相關機制有進一步的了解。

雖然目前對于無脊椎動物DNA甲基化的機制與功能已經有了一些較為確定的認識，但就總體而言，這個領域仍充滿了疑問。現已證明表觀遺傳調控機制比我們原來想象中更為復雜，涉及到多個層次不同系統間的相互關聯與作用。新的技術手段和分析方法有助于幫助我們進一步了解DNA甲基化的相關機制及其在表觀遺傳調控中的作用，對其將來的應用也將起到重要的參考作用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Invertebrates DNA M ethylation

Liu Ying Tang Yongzheng Gao Li
（Ocean School，Yantai University，Yantai264005）

DNA methylation is an important epigentic mechanism which can change organism’s transcriptome and phenotype without altering DNA sequence. In different evolutionary braches， the states of DNA methylation are fundamentally different. In invertebrates， DNA methylation usually occurs in transcription region and is closely related to genetic expression. Research shows that DNA methylation plays an important role in caste formation of social insects. It can improve the phenotypic plasticity of organism by increasing the amount of transcription variants via promoter recognition and exon skipping in highly fluctuating environments. This article reviewed the mechanism and function of DNA methylation in invertebrates to provide reference to related research and make prospects for future research.

DNA methylation；gene body methylation（GBM）；transcriptome

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.003

2014-12-08

國家自然科學基金項目（41273130），山東省高等學校科技計劃項目（J10LC22）

柳瑩，女，碩士，研究方向：分子生物學；E-mail：liuyinger@sina.com