植物無融合生殖研究進展

賈寧 唐研耀 曾燕如 趙國淼 徐亞楠

（浙江農林大學 浙江省亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300）

植物無融合生殖研究進展

賈寧 唐研耀 曾燕如 趙國淼 徐亞楠

（浙江農林大學 浙江省亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，臨安 311300）

無融合生殖是一種不發生雌雄配子核融合而產生種子的一種無性繁殖過程。有些無融合生殖產生的種子是其母本的克隆，可以保留母本的基因型，因此無融合生殖可用于雜種優勢的固定。盡管無融合生殖具有潛在的應用價值，但其形成機理十分復雜，表現在無融合生殖有多種表現形式，且受控的途徑多樣，遺傳機制復雜，至今尚無定論，研究方法也多種多樣。對近年來無融合生殖研究方面取得的進展進行了概述，旨在為深入研究無融合生殖提供參考。

無融合生殖；遺傳控制；表觀遺傳

無融合生殖是不發生雌雄配子核融合而產生種子的一種無性繁殖過程。無融合生殖可視為有性生殖過程在時空上的短路，從而導致某些細胞命運的改變和有性生殖過程關鍵步驟（如減數分裂和受精）的中止［1-3］。在無融合生殖植物中，種子的形成沒有經歷減數分裂中的交換或者受精，結果其子代在遺傳上是其母本的克隆，保留著母本的基因型［2-5］。因此，無論性狀在遺傳上有多復雜，無融合生殖植物均能通過種子繁殖，永久地保存感興趣的基因型，這在雜種優勢的保存方面起著極大的作用。當然，只有核遺傳的專性無融合生殖才能在雜種固定上有意義［6］。

目前，已在40余科400余種開花植物中發現存在無融合生殖現象，且預計實際遠不止這些，在具有代表性的單子葉植物及雙子葉植物中都存在這一現象［7］，甚至在地中海柏樹（Cupressus dupreziana）中發現了父本起源的無融合生殖［8，9］。無融合生殖中存在兼性無融合生殖現象，且常伴隨著多倍體現象，而其同種或相近物種有性繁殖的個體通常是二倍體［10，11］，如蘋果屬（Malus）植物中二倍體的種一般不具有無融合生殖能力，而多倍體種多具有較強的無融合生殖能力［12］。同一種植物可以在某一地區進行有性生殖，而在世界其它地區進行無融合生殖［13］。許多研究表明，無融合生殖是循環雜交的產物，或者在某種情況下是通過自動多倍體化產生的［14］。但Lovell等［15］對擬南芥（Arabidopsis thaliana）近親Boechera屬二倍體和三倍體無融合生殖家系的遺傳模式及其產生的有性后代進行研究發現，多倍體現象和雜交過程只是和Boechera屬的配子體無融合生殖相關，但并不是決定因素，而是遺傳因子的控制起著決定作用。無融合生殖植物具有功能性的花粉，通過授粉，控制無融合生殖的遺傳因子可傳遞到同屬的有性群體中，而有性的個體不會對卵細胞未經受精而產生種子的無融合生殖植物進行受精［16，17］。

無融合生殖機理極其復雜，但各國研究人員針對不同物種中發現的無融合生殖展開了研究。盡管研究角度及研究程度有所不同，但都取得了一定的進展。近年來，我們研究小組從連鎖分析的角度對山核桃（Carya cathayensis）無融合生殖開展了研究。本文就無融合生殖研究進展進行了綜述，以期為我們深入研究這一現象背后的機理提供參考。

1 無融合生殖胚囊形成早期階段的調控

最近，不少學者研究了無融合生殖胚囊形成早期階段調控的生物學機理，而研究無融合生殖的分子機理主要研究胚囊早期的發育過程以及胚是如何逃避受精而形成種子的［2-4］。Koltunow等［2］早在2003年就提出，無融合生殖始于一種在某一步驟或某些步驟脫調節的有性生殖形式。

玉米中發現了一種突變體，突變位點編碼AGO104，導致減數分裂時染色質不能螺旋化縮短，進而導致染色體不能分離和功能性未減數配子的形成［18］，而AGO104所屬的蛋白家族ARGONAUTE蛋白是RNA沉默復合體的關健組分［19］，說明RNA沉默在此過程中發揮著作用。此外，AGO104專門在性母細胞周圍的體細胞中積累，說明它是一個移動信號，而不是對性母細胞中轉錄的細胞自主調控［20］。

Koltunow等［5］發現，需要有性繁殖刺激胚珠內的無孢子生殖，啟動顯性位點LOSS OF APOMEIOSIS（LOA）的功能，由此促進有性進程（性）細胞（Sexually programmed cell）附近體細胞無孢子生殖起始（Aposporous initial，AI）細胞的分化，并抑制毗鄰的有性生殖途徑；無孢子胚囊中的LOSS OF PARTHENOGENESIS（LOP）位點使不依賴于受精的胚及胚乳能夠發育；在Hieracium caespitosum的無融合生殖中，這2個位點是獨立分離的［21］；去除這2個位點中任何一個位點會導致部分回復到有性生殖，而二位點功能的喪失會導致有性發育的回復；因而在無融合生殖物種中，無融合生殖與有性生殖可以互不排斥地共存，如果有性生殖的發生途徑失敗，則會啟動無融合生殖基因的表達，而后者是有性生殖的改變形式；這些位點不可能編碼對有性生殖而言關鍵的因子，但可借用有性途徑使無融合生殖成為可能；這些顯性位點的功能性滲透有可能導致產生稀有的源自兼性無融合生殖植物的有性子代［5］。進一步研究發現，LOA位點兩側具有豐富復雜的重復與轉座子序列，且在單雙子葉無融合生殖植物中具有趨同進化的現象，說明該位點是無融合生殖性狀功能發揮及維持所必需的［22］。

研究表明，在有性生殖物種減數分裂前的胚珠內來自孢子體胚珠（Sporophytic ovule，SO）細胞的信號對某些造孢細胞的數量有抑制和促進作用，這些造孢細胞具有起始雌配子體發育的潛力［23，24］。對擬南芥、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）的研究表明，當減數分裂前胚珠中孢子體組織涉及的某些信號如富亮氨酸受體樣激酶（Leu-rich receptorlike kinases）、ARGONAUTE蛋白、小RNA、和DNA甲基化酶的路徑遭到破壞時，可以導致大孢子母細胞（Megaspore mother cell，MMC）的敗育［25-29］。例如，玉米SO組織中ARGONAUTE蛋白功能的失常可以改變MMC的命運，使其繞過減數分裂過程直接形成一個二倍體胚囊［18］。最近，Tucker［30］和Okada等［31］基于對無融合Hieracium的研究，提出來自SO細胞的信號可以啟動LOA位點的表達，從而影響AI細胞的起始和無孢子胚囊的發育。此外，激素在植物生長、雌配子體發育和胚的形成中起著非常重要的作用［32-34］。Tucker 等［30］發現，Hieracium屬中無融合生殖起始的時間和進度受植物激素和LOA位點調控，植物激素可能作用于LOA位點的上游或者它們同時調控無融合生殖。

比較擬南芥近親Boechera屬二倍體有性生殖與二倍體無融合生殖物種大胞子母細胞階段微型解剖胚珠之間的差異表達基因標簽發現，無融合生殖基因表達方面的異時性［35-38］、基因組復制及古老雜交事件影響的證據［36，37］；無融合生殖胚珠在發育的早期與有性胚珠相比，在基因表達上表現為下調，且與甲基化途徑有關［39］，而在受精胚珠的階段，無融合生殖胚珠基因表達相對于有性胚珠又表現為上調［11，36，37，39］。

2 植物無融合生殖的遺傳機制研究

關于控制無融合的生殖遺傳機制，諸如基因數量及其顯隱性等問題，在不同的植物甚至在同一植物中得到了不同的結果［40-42］；即使在同一物種中也發現存在不同位點控制不同形式的無融合生殖現象［21］。一般來說專性無融合生殖是由單基因或少數基因控制的，且常表現為顯性，而兼性無融合生殖的遺傳基礎表現較為復雜，是受微效多基因和環境因素同時控制的，從而形成一種兼有無融合生殖和有性生殖兩種方式的遺傳平衡體系［43］；有些與無融合生殖有關的特定區域在不同物種中是高度保守的［9，44］。研究Pennisetum squamulatum 及Cenchrus ciliaris中配子體無融合生殖，發現其受到單顯性位點無孢子生殖特有基因組區（Apospory-specific genomic region，ASGR）的控制，該基因組區在這些物種中高度保守，含有數個在無融合生殖發育過程中起作用的基因，且有多類轉座因子，跨度達15-40 cM以上［45-48］；有趣的是，這些區域似乎是雜合的［48，49］。Grossniklaus等［49-51］早在2001年就提出，無融合生殖由單一的主基因控制或由多個緊密連鎖的基因復合體控制，它們位于減數分裂染色單體交換受抑制的區域。同樣的現象在水稻［8，50］、玉米［51］、Paspalum simplex［52］、 摩 擦 禾（Tripsacum dactyloides）［53］等單、雙子葉物種也存在，且相對有性生殖的近親，無融合生殖物種中共分離的片段長度達15-40 cM［50］，可以把它們當作單一的孟德爾遺傳性狀來看待［1，54］。這說明無融合生殖物種中存在大片段連鎖的現象或同一染色體中連鎖及非連鎖的片段同時存在。基于這些發現，在Hieracium caespitosum的無融合生殖研究中采用了缺失作圖的方法來定位與無融合生殖有關的片段［21］，但還是無法對實際存在的緊密連鎖大片段中的基因進行作圖/定位。此外，也有不連鎖多基因、單基因控制無融合生殖的研究報道［48，55，56］。對于不連鎖多基因控制的無融合生殖，基因間通過表達量的變化及互作來實現生殖模式的變化［56］。在所有生物中先發現無融合生殖由單基因控制，后又發現是由多基因控制的［21］。研究發現，平邑甜茶（Malus hepehensis var. pingyiensis）的無融合生殖以顯性單基因質量性狀為主，也有數量性狀效應［57］。

3 無融合生殖的表觀遺傳調控研究

3.1 無融合生殖的表觀遺傳模型

研究表明，有性生殖過程可能受表觀遺傳學調控的某些突變或下調基因控制而導致無融合生殖［2，50，58］，并將其稱之為表觀遺傳模型。表觀遺傳模型可以解釋無融合生殖發育過程中，不利于植物發育的無融合非減數分裂、單性生殖和假受精誘導自發胚乳形成3個過程同時共存的現象。因此表觀遺傳對無融合生殖的調控是宏觀的，可以同時對上述過程和多個位點進行調控。另外，表觀遺傳模型也可解釋無融合生殖的起源問題。目前一些學者認為，無融合生殖的起源是不同程度的突變累加的結果，但這一觀點遭到多數學者的反對，因為這些效應同時出現的可能性不大，只有表觀遺傳的突變或者調控才會導致大規模基因的表達變化，因此利用表觀遺傳模型解釋無融合生殖的起源更具有說服力［2］。

3.2 無融合生殖表觀遺傳調控的分子機制

目前對無融合生殖的表觀遺傳調控分子機制的研究主要集中在基因組印記和染色體水平的修飾兩個方面。被子植物的基因組印記主要發生在胚乳中。在假配合無融合生殖中，胚的發育無需父本的貢獻，而胚乳受精是必需的，以獲得正確的2m∶1p比，其背景正是通過基因組印跡使父母本基因組在表觀遺傳學上表現不同［59］。DNA甲基化修飾可以使基因組印記發生改變從而導致胚乳的自主發育［58］。Aguilar等［39，60］發現，在玉米胚珠中，基因組中的低甲基化可以誘導類似于無融合生殖的表型。在早期擬南芥的研究中發現，某些基因組的甲基化程度也與胚乳自主發育有關。基因表達的活性主要受染色體狀態決定，染色體水平上的表觀遺傳調控使營養生長向生殖生長轉變的機制尚不清楚。在對擬南芥ago 9突變體的研究發現，ARGONAUTE 9在胚珠體細胞中表達并調控配子體的分化過程，該突變體的胚珠可以形成多個類似于無孢子體類型的孢子，表明染色體水平上的修飾對無融合生殖的產生起著十分重要的作用［28］。此外，Ravi等［61］發現擬南芥中著絲粒特異表達組蛋白CENH3過量表達會產生單性生殖現象。

4 控制無融合生殖的基因研究

無融合生殖是由遺傳基因控制的［41］，并陸續發現了無融合生殖相關的基因［59，62-66］，其中一些與無融合生殖胚乳形成有關，如FIS類基因、MSI1基因［59，62，67，68］；一些與胚的形成有關，如rolB 基因、PGA6/WUS基因、BBM基因、SERK類基因和LEC類基因［63-65］；還有一些與減數分裂相關，如SWI1基因、SPL/NZZ基因［69，70］，但這些基因在不同物種中并不是等效的，如與胚形成有關的SERK基因在平邑甜茶和四倍性后代花前各試材的表達差異大于花后時期，但表達強度與胚胎發育時期和無融合生殖率高低沒有確切關系［71］。Marimuthu等［72］通過擬南芥MiMe與dyad突變體雜交，獲得了34%無性雌性或雄性配子轉化成無融合合成的種子的子代個體，它們是其親本的克隆，表明通過對有性植物中2-4個保守基因的操作，可以實現通過種子的無性繁殖。由于進行無融合生殖的植物大多數是多倍體，而且存在兼性無融合生殖，突變重組體很難得到，也不易進行分析，且無融合生殖類型多，過程和機制也不盡相同，所以從無融合生殖材料中克隆那些控制有性生殖途徑和無融合生殖途徑基因是很難的［70］，但也有利用SCAR標記等分離無融合生殖基因［21］、轉基因［73］的報道。

5 分子標記與遺傳定位在無融合生殖研究中的應用

事實上，無融合生殖研究至今尚未確定其核心遺傳元件［39］，未分離到相關的基因［74］。同時人們對基因如何控制無融合生殖，這些基因在整個基因組的分布及具體位置，在植物育種中如何整合這些基因的作用所知甚少。

已經證明，遺傳定位是解決這些問題強有力的方法，它旨在將復雜的表型解析成各個對表型發生作用的稱之為數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL）的基因［75］。遺傳定位方法的原理是連鎖分析，即在減數分裂中兩同源染色體間的交換產生重組的配子，通過計算重組配子占總配子數量的比率來量化并檢測基因間的連鎖程度［76-78］。分子標記技術的發展為連鎖分析打開了方便之門，而連鎖分析的最終目的是在構建遺傳圖譜的基礎上定位與標記相連鎖的基因/數量性狀位點。Noyes等［79］利用AFLP標記曾經對Erigeron屬一個三倍體無融合生殖物種與一個二倍體有性生殖物種的雜交子代群體進行分析，定位出2個獨立的控制無融合生殖的位點，表明不完全減數分裂與孤雌生殖是非連鎖獨立遺傳的。以無融合山核桃（Carya cathayensis Sarg.）［80］、美國山核桃（Carya illinoensis）為研究材料，我們在混合模型的框架內，在連鎖分析的模型中整合了無融合生殖；新模型不但能準確地對標記的連鎖進行估計，且能檢測無融合生殖比率及減數分裂過程中遺傳干擾的程度［81］。此外，我們還發展了利用連鎖分析來分析基因型到物種無融合現象多樣化的模型［82］，無融合生殖物種中定位QTL的模型［83］，說明連鎖分析可用于無融合生殖的研究。事實上，我們的研究表明，山核桃中存在印跡QTL［84］，而印跡效應多與甲基化有關，進而產生表觀遺傳學的效應。

此外，自1993年分子標記首次用于無融合生殖研究以來［85］，分子標記（RAPD、SCAR、AFLP、SSR）已在多種植物中用于區分同一物種中的無融合生殖與有性生殖［86-91］、無融合生殖個體的同一性鑒定（RAPD）［92］，以及以無融合生殖個體為親本的雜種后代鑒定（RAPD、RFLP）［93，94］與親子代分析（SSR、RAPD）［95，96］，或發現與無融合生殖基因連鎖的標記［48，97］。Ruiz等［90］以柑橘（Citrus reticulata）為材料的研究結果表明，利用同工酶在有些群體中未能揭示出無融合生殖個體與有性生殖個體的差異，而利用 SSR 就可揭示出兩者之間的差異；劉麗等［98］在龍須草（Eulaliopsis binata）中開發了SSR引物，并證明開發的SSR引物可揭示龍須草生殖方式的復雜性，適用于龍須草遺傳分析及親緣關系鑒定。但其中生殖方式的區分往往是在已知有性與無融合生殖方式的前提下進行，并在此基礎上進行mRNA、cDNA差顯分析，不同程度地獲得了一些與無融合生殖相關或無融合生殖特有的片段［44，48，99-103］。例如，利用cDNA-AFLP對Paspalum simplex無融合生殖與有性生殖基因型進行轉錄組比較，發現了無融合生殖花發育特定階段位于控制無融合生殖位點的擴增子［38］。

6 植物無融合生殖的研究方法

實際上目前有多種方法可以研究植物無融合生殖，主要的方法有形態觀察法、顯微觀察法（胚胎學觀察［104］、胼胝質的沉積觀察、染色體數目觀察）、生化鑒定法（包括化學成分分析與同功酶分析）、分子生物學方法（包括分子標記及無融合生殖相關基因的篩選和鑒定）［42］、去雄套袋法、生長素測試法、測定無融合生殖植物中有性和無融合生殖發生比例的流式細胞種子篩選技術（尤其適用于鑒定需要假受精的無融合生殖種類方面）、外源標記基因轉入法［105］等。

形態學觀察法中有包括異花授粉植物中產生整齊一致的后代或典型的母本后代、一籽多苗（多胚）現象等在內的7種可作為初步識別植物無融合生殖的形態特征［106，107］，但其要求親本形態性狀在某些方面要有顯著差異，且該性狀在雜種一代須表現為顯性，這樣可用的遺傳性狀并不多［42，105］，且有時形態性狀與無融合生殖并無關系，如苧麻（Boehmeria nivea）的多胚現象［108］。

流式細胞儀主要用于無融合生殖植物中有性和無融合生殖發生比例的鑒定［75］，可以鑒定體細胞染色體倍性［57］，因為有研究發現，無融合生殖能力與倍性存在一定的相關性［16］，同時，流式細胞儀還可以用于無融合生殖方式的鑒定，如有性生殖的種子胚乳與胚的倍性比為1.5∶1，不需要假受精的無融合生殖種子胚乳與胚的倍性比為2∶1，需要假受精的無融合種子胚乳與胚的倍性比為 2.5∶1；如果同時出現胚乳與胚的倍性比為1.5∶1及2∶1，則既進行了有性生殖，又進行了不需要假受精的無融合生殖［109，110］。

同功酶法主要用一些同功酶來判斷無融合生殖個體其同功酶的一致性/整齊度［111，112］及區分有性生殖與無融合生殖，但同工酶分析法要求親本在酶譜上有差異。在植物的群體研究中，僅有10-20 種同工酶表現出位點的多態性，且目前還沒有發現與無融合生殖緊密連鎖的酶［42］。

最近，Tucker和Okada等［30，31］使用激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM）技術分離出無融合生殖Hieracium 屬胚囊形成早期階段的3種細胞類型（SO細胞、AI細胞、早期無孢子生殖胚囊細胞），并從這3種細胞類型中分別提取RNA來研究無孢子生殖胚囊形成過程中的基因表達調控。研究發現，AI細胞和EAE的轉錄組十分相似，證明AI細胞在進行有絲分裂之前就已經轉化成了一個無孢子生殖胚囊［31］。

綜上所述，形成無融合生殖的途徑有多種，機理也很復雜。在對Hieracium屬植物無融合生殖研究中發現了3條偏離有性生殖而發生的無融合生殖途徑；在Hieracium caespitosum中有2個DNA區域共同控制2種無融合生殖途徑［21］。因此，對于無融合生殖的鑒定與研究，單從一個方面的研究來下結論可能會有較大的差別，所以要結合胚胎學、細胞學、遺傳學、分子生物學等多種方法對無融合生殖進行客觀的分析。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Apomixis in Plants

Jia Ning Tang Yanyao Zeng Yanru Zhao Guomiao Xu Ya’nan
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A & F University，Lin’an 311300）

Apomixis is an asexual propagation through seeds in which embryo is formed without the nuclear fusion of male and female gametes. Since some resultant seeds of apomixis are clones of their maternal parent， they are identical to their maternal parent in genotype. Therefore， apomixis could be used in the fixation of heterosis. Apomixes has abundant potential application values， however， the mechanism for apomictic formation is very complicated， which was represented by multi-forms of apomixis that are controlled by varied pathways， the complicated genetic mechanism that has not been determined and finalized， and diverse methods of studying it. In recent years， apomixis has been studied in terms of linkage analysis. This paper outlines research progress on apomixis， aiming at providing

for in-depth study.

apomixis；genetic control；epigenetics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.003

2015-01-25

國家自然科學基金資助項目（31370678）

賈寧，男，碩士研究生，研究方向：林木重要經濟性狀的遺傳規律與種質創新；E-mail：981183096@qq.com

曾燕如，博士，教授，研究方向：林木重要經濟性狀的遺傳規律與種質創新；E-mail：yrzeng@zafu.edu.cn