pH對重組CHO細胞生長、單抗表達及質量的影響

肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

（廣東東陽光藥業有限公司，東莞 523000）

pH對重組CHO細胞生長、單抗表達及質量的影響

肖尚 鄧崇飛 柯軍 鄢成偉 孫文正 楊彬

（廣東東陽光藥業有限公司，東莞 523000）

在1 L反應器中探究pH對CHO細胞生長、單抗表達及質量的影響。在1 L反應器中對pH進行探究，實驗研究表明當pH為7.05時最適合CHO細胞生長和抗體表達，在此條件下培養時第9天獲得最高細胞密度1.54×107cells/mL，在第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L。pH對pCO2、乳酸積累、抗體的單體含量、電荷異質性和糖基化也有較大影響，當pH在6.95至7.25之間時，高pH培養能夠降低乳酸積累和pCO2，但是會導致抗體的堿性峰增加。pH兩項培養能夠降低細胞活力，從而提高抗體表達量。

pH；CHO細胞；抗體；pCO2；電荷異質性

單抗類藥物的出現為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開辟了廣闊前景，在為人類健康作出突出貢獻的同時也為企業帶來非常可觀的收入，已成為近年來銷售額最高的一類生物技術藥物［1-3］。雖然哺乳動物細胞培養技術要求高、抗體表達能力低、生產成本高，但具有其它表達系統無法取代的優勢：能夠準確的完成糖基化、折疊、鏈內及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾，因此其表達的抗體在分子結構、理化特性和生物學功能方面更接近天然產物［4］。自1996年以來，FDA批準的生物技術產品中，有2/3以上是通過哺乳動物細胞系統生產的［5］。中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培養的優勢，是目前使用最廣泛的哺乳動物細胞表達系統［6］。目前使用最廣泛的CHO表達系統是二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase，GS）表達系統。

目前國內很多科研院校和企業的宿主細胞抗體表達水平都很低，抗體濃度多處于1 000 mg/L以內［7］，很難用于實際生產。而在發達國家，宿主細胞抗體表達量往往都在1 000 mg/L以上［8-10］。其次，我國動物細胞培養技術還不成熟，與發達國家差距較大。目前我國動物細胞培養更多的工作是為了提高抗體的表達量而很少關注抗體的質量。動物細胞培養技術已成為我國抗體類藥物走向產業化、實現其經濟價值，滿足市場需求的瓶頸［3］。

目前動物細胞大規模培養的主流方式是利用攪拌式生物反應器進行流加培養，相應的反應器放大設計和操作成為新的挑戰，這其中的主要關鍵技術涉及剪切力、氧傳遞、均一性、二氧化碳分壓（pCO2）控制、pH控制、滲透壓及抗體的質量等問題［11-15］。本研究主要探究pH對CHO細胞生長、抗體表達及質量、pCO2等的影響，以期為國內細胞培養工藝和QbD方法運用時風險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CHO細胞 所用CHO細胞為GS-CHO，表達抗TNFα抗體，由本實驗自主構建并保藏。

1.1.2 培養基 所用基礎培養基為CD EfficientFeedTMB，購買至Gibco公司。所用流加培養基為Acti CHO Feed-A CD和Acti CHO Feed-B CD，均購買至PAA公司。

1.1.3 主要儀器 細胞活力分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；1 L生物反應器（荷蘭Applikon生物技術公司）；NOVA多參數生化分析儀（美國Nova生物有限公司）；高效液相色譜安（安捷倫科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 培養方法 將液氮冷凍保藏的CHO細胞復蘇后，裝入一次性搖瓶在37℃、130 r/min、8%的CO2條件下進行擴大培養，每3 d傳代1次，傳代密度為5×105個/mL。最后將細胞以10×105個/ mL的密度接入1 L反應器進行發酵培養。

1.2.2 細胞計數及活力分析 臺盼藍染色后由細胞活力分析儀自動計數及分析活力。

1.2.3 葡萄糖、谷氨酸、管氨酰胺、乳酸、銨根、pCO2測定 使用NOVA多參數生化分析儀測定。

1.2.4 HPLC法檢測抗TNFα抗體濃度 用0.1 mol/L磷酸緩沖液以2 mL/min流速平衡HPLC系統15 min至基線平穩，于系統程序中設置標準曲線法程序。進樣50 μL于進樣器，以2 mL/min流速洗脫，記錄有關數據，并進行處理。

1.2.5 HPLC法檢測抗TNFα抗體電荷異質性 進樣體積100 μL，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，樣品盤溫度8℃，柱溫40℃，運行時間22 min。

1.2.6 毛細管電泳測定抗TNFα單抗純度 毛細管電泳系統分別用1 mol/ L NaOH 洗5 min、水洗5 min及分離緩沖液洗10 min。每次進樣前，分別用0.1 mol/L NaOH 及分離緩沖液洗1 min 后即可進樣。毛細管長30.2 cm，有效長度20 cm，檢測波長220 nm，柱溫25℃，樣品盤15℃。

1.2.7 HPLC-MS檢測抗TNFα抗體糖基化 色譜條件（色譜柱：Agilent-C8，75×2.1 mm，5 μm，300埃）：進樣體積2 μL，檢測波長280 nm，流速0.5 mL/min，柱溫75℃，樣品盤溫度8℃；

質譜條件：儀器模式Auto MS/MS，離子模式Dual AJS ESI源，陽離子，干燥氣體N2，12 L/min，325℃；碰撞電壓260 V；工作電壓65 V；毛細管電壓4 000 V；夾套氣體溫度（流速）：350℃，12 L/min；氣體溫度325℃；VCap：3 500 V；噴頭電壓1 000 V；分離器電壓65 V；OCT 1 RF Vpp電壓750 V；質量范圍500-3 200 m/z。

1.2.8 HPLC法檢測抗TNFα抗體多聚體含量 取25 μL樣品加緩沖液1 mL稀釋，上樣10 μL，流速0.5 mL/min；檢測波長為280 nm。

2 結果

2.1 單相pH培養對CHO細胞的影響

在1 L反應器中探究pH對CHO細胞生長、抗體表達等生理代謝的影響，選擇研究的pH范圍為6.95至7.25，用CO2和7.5%的碳酸氫鈉來控制pH，pH控制的死區范圍為±0.05，實驗平行數為2。1 L反應器初始培養體積為400 mL，接種密度為1.0E+ 06 cells/mL，OD控制在40%；轉速第0天到第5天為150 r/min，之后為196 r/min，培養溫度均為37℃恒溫。培養初期用空氣調節OD，當通入的空氣量超過0.1V VM之后改通純氧。培養至第3天后每隔24 h流加9.6 mL cti CHO Feed-A CD和0.96 mL Acti CHO Feed-B CD。共培養11 d，實驗結果如圖1所示。

圖1 pH對CHO細胞生長的影響

一般pH低于6.8或者大于7.3不適于CHO細胞的生長。通過圖2發現隨著pH的增加活細胞密度和抗體表達量都呈現出先增大后降低的趨勢。對于本實驗所用CHO細胞，最優pH為7.05，在此條件下培養第9天獲得最大細胞密度1.54×107個/mL，第11天獲得最高抗體濃度1 355.71 mg/L，但當pH為6.95時在第9天獲得最大的每天單細胞抗體表達量（SPR）為26.04 pg。

圖2 pH對CHO細胞抗體表達的影響

動物細胞培養時pCO2受各種因素的影響：pH、通氣、培養基成分、細胞代謝等。在本實驗中發現在培養的過程中pCO2呈現出先下降后上升的趨勢（圖3），這主要是由于CHO細胞培養時前期產生乳酸，中和培養基中堿性物質，導致pCO2降低（圖4）。后期由于營養需求較大，乳酸產生的速率較低甚至被消耗，且細胞密度較高，細胞代謝產生大量CO2，無法及時排出，導致pCO2上升。對于相同的培養基，當培養時設定的pH值越低，pCO2值越大，可能是由于需要更多的CO2去降低培養基的pH。

從表1中可以看出pH對抗體的非還原純度和電荷異質性有影響，對多聚體影響不大。隨著pH的增大，抗體非還原純度呈現先上升后下降的趨勢，在pH為7.05時獲得最大抗體非還原純度96.85%；隨著pH的增加，抗體主峰在下降，堿性峰在上升，酸性峰總體呈現下降的趨勢，但變化量很小。表2說明pH對抗體的糖基化有影響，隨著pH的增大G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升。

2.2 兩相pH對CHO細胞的影響

在1 L反應器中探究在第9天將pH從初始7.05轉成6.95時對細胞抗體表達的影響，結果如圖5所示。pH能夠影響許多酶的活性，從而對細胞的生長、抗體表達、抗體質量等有比較大的影響。圖6顯示出當pH從7.05調至6.95，活細胞密度和細胞活率都有所下降，但由于pH變化幅度比較小，所以對細胞沒有造成嚴重的損傷，活細胞密度和細胞活率下降程度不大。

圖3 pH對pCO2的影響

圖4 pH對乳酸積累的影響

表1 pH對抗體純度及電荷異質性的影響

表2 pH對抗體糖基化的影響

圖5 pH兩項培養對細胞生長的影響

圖6 pH兩項培養對抗體表達的影響

pH調整后SPR值有所上升，使得最后獲得的抗體濃度比單項pH培養時要高。這些可能是由于細胞自身的代謝和抗體表達都需要消耗營養物質和能量，而抗體在后期大量表達，導致后期營養和能量需求比較大，流加的營養和細胞自身所產生的能量不能同時滿足細胞生長和抗體表達所需。當pH調至6.95后細胞密度和活率有所降低，減少了由于細胞自身生理代謝所消耗的營養和能量，就使得有更多的營養和能量用于抗體合成。

3 討論

以動物細胞為載體生產單克隆抗體已越來越受到重視，但目前國內的研究更多的停留在培養基開發［20］和工藝開發［7］上，很少關注單抗的質量屬性。目前國際制藥巨頭已經深入理解和實施QbD 理論，將工藝與藥品的質量聯系起來，做到藥品的質量是生產出來的而不是檢測出來。而國內的企業對工藝與產品質量之間的聯系研究不夠深入，不能很好的實施QbD理論。本研究考察了pH對CHO的生長、活力及單抗的表達量、非還原純度（純化后）、電荷異質性、糖基化、多聚體的影響，將生產工藝與單抗質量建立聯系。

pH設定點的不同會對細胞內許多酶的活性產生重要影響從而對細胞的生長、活力以及單抗表達有很大的影響，這在國內外有很多文獻報道。pH兩相培養能夠降低細胞活力，從而將更多地營養和能量提供給抗體合成，提高單抗表達量。

由于CHO細胞培養時前期產生大量乳酸，中和培養基中堿性物質，使得CO2溢出培養基，導致pCO2降低。后期細胞培養營養需求大，乳酸從積累變成消耗，且細胞密度較高，細胞代謝產生大量CO2，無法及時排出，導致pCO2上升，所以pCO2呈現先上升后下降的趨勢。

研究結果表明pH對單抗的電荷異質性和半乳糖糖基化有較大影響，半乳糖糖基化對抗體的ADCC和CDC效應有重要影響。隨著pH的增加，抗體主峰在下降，堿性峰在上升，酸性峰總體呈現較小趨勢的下降，G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升。抗體非還原純度對單抗的免疫源性有重要影響，pH對單抗的非還原純度（純化后）有影響，隨著pH的增大，呈現先上升后下降的趨勢，在pH為7.05時獲得最大抗體非還原純度96.85%。

由于pH對單抗的質量有重要影響，并且細胞培養時pH值偏離設計空間的可能性較大，因此在運用QbD方法生產單抗藥物時，對pH進行風險評估可將pH列為關鍵工藝參數。

4 結論

當pH為7.05時最適合本實驗室CHO細胞生長和抗體表達。在本研究的pH范圍內，高pH培養能夠降低pCO2，但是卻促進了乳酸的積累；抗體的非還原純度隨著pH的增加呈現先增高后降低的趨勢；較高的pH會導致堿性峰增高，主峰降低，但對酸性峰影響不大；當培養的pH增加時G2F、G1F含量在下降，G0F、G1F-GN含量在上升。pH兩項培養能夠降低后期細胞活力和促進抗體表達。。

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（責任編輯李楠）

The Effects of pH on Cell Growth，Monoclonal Antibody Expression and Quality of a Recombinant CHO Strain

Xiao Shang Deng Chongfei Ke Jun Yan Chengwei Sun Wenzheng Yang Bin
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523000）

It was to study the effect of pH on the growth， monoclonal antibody expression and produce quality of a rewmbinant CHO strain. The results showed that the optimal pH for cell growth and the production of monoclonal antibody（mAb）was 7.05. Under this pH， a peak viable cell density was 1.54×107cells/mL at day 9 and the highest harvested antibody concentration was 1 355.71 mg/L after cultivating for 11 days. In addition， pH significantly affected the accumulation of pCO2and lactate in cell cultures， as well as the expressed product’s quality including its monomer ratio， charge variant species， and glycosylation pattern. While pH ranging from 6.95 to 7.25， cell cultures at higher pH reduced pCO2and the accumulation of lactate， but led the alkaline peak of antibody increase. Cultures at 2 sets of pH decreased the cell activity，therefore increased the expression of antibody.

pH；CHO cell；antibody；pCO2；charge variants

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.037

2015-03-10

廣東省引進創新科研團隊計劃（201101Y0104990178）

肖尚，男，碩士研究生，研究方向：動物細胞大規模培養；E-mail：xiaoshang@hecpharm.com

楊彬，男，工程師，碩士研究生，研究方向：單抗生產；E-mail：547860796@qq.com