產D-乳酸重組大腸桿菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步發酵

丁小云 顧健健 王永澤 趙錦芳 王金華 趙筱

（湖北工業大學輕工學部 發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068）

產D-乳酸重組大腸桿菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步發酵

丁小云 顧健健 王永澤 趙錦芳 王金華 趙筱

（湖北工業大學輕工學部 發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068）

為構建能夠同時高效利用五碳糖和六碳糖發酵產D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌，以能高效利用五碳糖發酵產D-乳酸的大腸桿菌工程菌E.coli JH13為出發菌株，通過Red同源重組技術敲除葡萄糖跨膜轉運基因ptsG。實驗結果表明，ptsG缺陷菌株E.coli JH15在10%混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）培養基中發酵，可同時利用五碳糖和六碳糖以完成發酵；而對照菌葡萄糖消耗完才利用木糖，發酵結束還有 18 g/L木糖殘留；JH15乳酸產量為83.04 g/L，相比于對照菌株提高了25.86%；在稻草秸稈水解液中發酵，JH15同時利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，乳酸產量為25.15 g/L，轉化率為86.42%。JH15 作為能利用混合糖同步發酵產D-乳酸的大腸桿菌工程菌，它的成功構建為利用廉價的木質纖維素水解物為原料發酵生產D-乳酸提供參考依據。

重組大腸桿菌工程菌；D-乳酸；ptsG基因；Red同源重組；混合糖

D-乳酸是一種重要的手性中間體，其聚合物具有較高的熱穩定性，可制成生物可降解材料，因此其生產和應用受到廣泛關注，成為目前研究的熱點［1，2］。微生物發酵法由于原料來源廣泛、生產成本低、光學純度高、安全性高等優點已成為國內外生產D-乳酸的主要方法［3］。目前D-乳酸的生產主要以葡萄糖作為底物。自然界中生物質種類繁多，分布廣泛，且數量巨大，價格低廉。木質纖維素的水解產物富含大量糖類，包括葡萄糖、木糖、阿拉伯通和半乳糖等［4］。這些混合糖可以作為碳源用以微生物發酵生產。如果能以木質纖維素水解后的混合糖替代葡萄糖作為碳源用于微生物發酵就能夠節省生產成本，同時將如秸稈等農業廢棄物加以利用，變廢為寶，有益于保護環境。但是利用混合糖進行發酵面臨著兩個難題：（1）混合糖中的六碳糖較容易被微生物利用，但木糖等五碳糖很少有微生物能夠利用；（2）利用混合糖發酵時大腸桿菌優先利用六碳糖，待六碳糖消耗完才利用五碳糖，而利用五碳糖特別是木糖前有一段很長的停滯期，相比于純木糖其利用速度較慢，且通常木糖沒能利用完［5］。

在兩種混合碳源環境中大腸桿菌通常優先利用其中容易代謝的一種（通常是葡萄糖），待前一種耗盡和一段停滯期后再開始利用另一種碳源，這種葡萄糖代謝對其他碳源利用的抑制作用被稱為分解代謝產物阻遏（Carbon catabolite repression，CCR），有時也稱為葡萄糖效應（Glucose effect）［6-8］。大量研究表明，CCR的產生與糖類磷酸轉移酶系統（PTS轉運系統）有關［9］。PTS系統負責特異性地將葡萄糖從細胞外跨膜主動運輸進入細胞，并在此過程中，將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，進入糖酵解途徑［10］。PTS系統包括EⅠ、HPr以及EIIs，前兩者是非特異性的可溶性胞質蛋白，后者為蛋白復合體，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EIIAGlc、EIICBGlc等，其中crr 基因編碼的EIIAGlc以及ptsG基因編碼的EIICBGlc在葡萄糖磷酸化轉運中起主要作用［11，12］。通過敲除ptsG基因可以降低葡萄糖由胞外向胞內轉運的速度，提高胞內EIIAGlc的磷酸化水平，降低葡萄糖抑制效應。

本研究選用糖類代謝范圍廣的大腸桿菌工程菌E.coli JH13為出發菌株，該菌是在能利用五碳糖產高純度L-乳酸的大腸桿菌基因工程菌E.coli JH12［13-16］的基礎上通過Red同源重組技術將乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的L-乳酸脫氫酶（L-lactatedehydrogenase，L-ldh）基因置換成D-乳酸脫氫酶（ldhA）基因，構建的一株能利用五碳糖產D-乳酸的大腸桿菌基因工程菌。在該菌的基礎上通過Red同源重組技術敲除葡萄糖跨膜轉運基因ptsG，降低葡萄糖抑制效應，構建一株能夠同時高效利用五碳糖和六碳糖發酵產D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 出發菌株E.coli JH13是能夠高效利用五碳糖發酵產D-乳酸的工程菌，其來源于野生菌株E.coli B，菌株JH13敲除了丙酮酸甲酸裂解酶（focA-pflB）、延胡索酸還原酶（frdABCD）、乙酸激酶（ackA）、乙醇脫氫酶（adhE）基因，并通過無氧啟動子融合表達技術倍增了NADH還原力，能夠在無氧條件下良好生長，由本實驗室保存。質粒pKD46（溫度敏感型復制子，Ampr）和pKD4（含有卡那霉素抗性基因Kanr）由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA marker，PCR Master Mix購自Fermentas公司，氨芐青霉素和卡那霉素購自Mersco公司，D-乳酸標樣購于Sigma公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分析純葡萄糖、木糖及其他無機鹽等購于國藥集團。

Sartorius BB-8846880發酵罐（德國Sartorius Stedim Biotech公司），Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），mycycler PCR儀（美國Bio-Rad公司），MicroPluser 電轉儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L；種子培養基：LB培養基加2%葡萄糖；發酵培養基：LB培養基加5%葡萄糖和5%木糖；選擇培養基：LB固體培養基加2%葡萄糖加抗生素（50 mg/L氨芐青霉素或卡那霉素）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設計 根據質粒pKD4及ptsG的基因序列設計敲除引物P1、P2，這對引物為兩側帶ptsG同源臂的卡那霉素抗性基因片段的擴增引物，靠近5'端未加下劃線的序列與ptsG基因序列相同，靠近3'段加下劃線的序列與質粒pKD4上卡那霉素抗性基因序列一致；P3、P4為ptsG基因敲除后的驗證引物，該引物序列與擴增引物上ptsG同源臂序列一致，如表 1所示。

1.2.2 ptsG基因的敲除 根據ptsG基因序列設計特異性引物P1和P2，該對引物一端與ptsG基因序列一致，另一端為卡那霉素抗性基因序列。以pKD4質粒為模板，進行PCR擴增，得到兩端帶有ptsG 同源臂的卡那霉素抗性基因片段。擴增條件為：95℃3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 5 min。用CaCl2法將pKD46轉化到E.coli JH13細胞中，經過氨芐青霉素抗性平板篩選后得到陽性菌落。通過電轉方法將擴增的卡那霉素抗性基因片段電轉到L-阿拉伯糖誘導過的E.coli JH13/pKD46感受態細胞中，30℃復蘇培養2 h，立刻涂布于含卡那霉素的LB培養基抗性平板上。37℃培養24 h，挑選生長較大的單菌落在卡那霉素抗性平板上轉接2-3次，以P3、P4為引物進行PCR驗證。將ptsG基因成功敲除的菌株命名為E.coli JH15。

表1 敲除基因的擴增引物和鑒定引物

1.2.3 發酵罐發酵培養 從LB平板上挑一個單菌落，接種于含有10 mL種子培養液的無氧管中，37℃過夜培養。取2 mL菌液接種于300 mL種子液中，37℃下150 r/min培養至OD600= 1.0-1.5。以10%的接種量將菌液接種至3 L發酵培養基（5%葡萄糖加5%木糖）中，置于帶自動調節系統的7 L發酵罐中，37℃下150 r/min培養發酵，流加3 mol/L Ca（OH）2控制pH為7.0。定時取樣，測定菌體濃度、葡萄糖、木糖、乳酸及其它代謝產物的濃度。

1.2.4 秸稈水解液發酵 稱取300 g粉碎后的秸稈，按10%（W/V）固液比加入2%（W/V）H2SO4，混勻后置于高壓滅菌鍋中處理1 h，冷卻后添加Ca（OH）2至pH達到10。置于90℃水浴鍋保持30 min，待其冷卻至室溫，用6 mol/L的H2SO4或HCl將pH調至中性，離心或濾紙過濾除去不溶性固體，液體部分裝入發酵罐滅菌。稱取10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母粉，單獨滅菌后加入發酵罐。以10%的接種量進行接種，并用無菌水定容至3 L。37℃下150 r/min培養發酵，流加3 mol/L Ca（OH）2控制pH為7.0。定時取樣，測定葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及乳酸的濃度。

1.2.5 發酵產物檢測與分析 菌體濃度測定時先用3 mol/L HCl溶液酸解，再在可見光分光光度計測定波長600 nm下OD值。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和有機酸采用高效液相色譜法分析，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，流動相為4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測器為PDA、ELS檢測器。

2 結果

2.1 ptsG基因缺陷菌株JH15的鑒定

用鑒定引物P3、P4對ptsG缺失菌株JH15進行PCR驗證，以出發菌株JH13為對照。由于鑒定引物P3、P4的基因序列與卡那霉素抗性基因擴增引物上ptsG同源臂的基因序列一致，所以敲除成功菌株擴增出來的片段大小應與卡那霉素抗性基因擴增片段的大小相同。結果如圖 1所示，以JH13為底物擴增的ptsG片段大小為1 434 bp；JH15和卡那霉素抗性基因的擴增片段大小均為1 550 bp，與ptsG自身長度相差116 bp，表明ptsG基因已成功敲除。

2.2 混合糖發酵

2.2.1 JH13和JH15菌體生長曲線 為了測試ptsG缺陷菌株JH15利用混合糖發酵的情況，本實驗在帶有pH 自動調節功能的7 L發酵罐中進行。JH13和JH15菌體生長曲線如圖2所示，出發菌JH13發酵到24 h時OD600達到4.6，之后進入穩定期；工程菌JH15在36 h進入穩定期，OD600值為5.3。在0-24 h之間JH13的OD600值比JH15大；但隨著發酵的進行，發酵24 h后JH15的OD600值反而超過了JH13。JH15的最大OD600值是JH13的1.15倍。

2.2.2 葡萄糖和木糖消耗曲線 JH13和JH15耗糖情況如圖 3 所示，在114 h的發酵過程中，ptsG缺陷菌株JH15在混合糖發酵過程中葡萄糖和木糖同時消耗；而對照菌JH13優先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完才開始利用木糖。說明ptsG基因的敲除確實能夠降低葡萄糖抑制效應，同時利用葡萄糖和木糖進行發酵。

JH15在發酵36 h時葡萄糖消耗完，發酵114 h木糖利用完，發酵結束；JH13發酵21 h葡萄糖消耗完才開始利用木糖，發酵114 h時還有18 g/L木糖殘留。表 2 所示，JH15葡萄糖的消耗速率為1.39 g/（L·h），木糖消耗速率為0.44 g/（L·h）；JH13葡萄糖消耗速率為2.38 g/（L·h），木糖消耗速率為0.34 g/（L·h）。與JH13相比JH15葡萄糖消耗速率降低了41.6%，但是木糖的消耗速率提高了29.41%。這是由于ptsG基因的敲除阻斷了葡萄糖的主要運輸途徑（PTS轉運系統），導致葡萄糖的轉運速度降低，但是敲除ptsG基因降低了代謝產物阻遏效應，在利用葡萄糖的同時利用木糖，這樣就提高了木糖的利用率。

圖1 ptsG基因敲除驗證

圖2 ptsG缺陷菌JH15和出發菌JH13在混合糖培養基中的菌體生長曲線

2.2.3 乳酸產量 圖 4 和表2所示，發酵30 h以前對照菌JH13的乳酸產量高于ptsG缺陷菌株JH15，發酵30 h后JH15的乳酸產量反而高于JH13；發酵114 h，JH15乳酸產量為83.04 g/L，轉化率為83.04%；而JH13乳酸產量為66.02 g/L，轉化率為80.51%。實驗表明ptsG基因的敲除使得JH15相比于JH13最大生產強度提高了2.37%，平均生產強度提高了25.86%。

圖3 ptsG缺陷菌JH15和對照菌JH13混合糖發酵（7 L發酵罐，50 g/L葡萄糖，50 g/L木糖）糖消耗曲線

圖4 ptsG缺陷菌JH15和對照菌JH13混合糖發酵（7 L發酵罐，50 g/L葡萄糖，50 g/L木糖）的乳酸產量曲線

2.3 稻草秸稈水解液發酵

為了驗證ptsG缺陷菌株JH15利用木質纖維素水解液發酵的情況，本實驗以稻草秸稈為原料經過2%的H2SO4酸解和Ca（OH）2脫毒處理后得到秸稈水解液。以秸稈水解液為碳源，添加10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母粉，配制成3 L發酵培養基。水解液中主要含有葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，其中葡萄糖濃度為16.5 g/L、木糖9.8 g/L、L-阿拉伯糖2.8 g/L。

表2 JH13和JH15在混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發酵中的比較

JH15利用秸稈水解液發酵情況如圖5所示，JH15生長速度逐漸加快，12 h時OD600達到2.5，隨后生長速度減慢。JH15在發酵過程中同時利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，15 h時發酵結束。其中葡萄糖在12 h消耗完，消耗速率為1.37 g/（L·h）；木糖和L-阿拉伯糖15 h消耗完，木糖消耗速率為0.65 g/（L·h），L-阿拉伯糖消耗速率為0.19 g/（L·h）。發酵結束時乳酸產量為25.12 g/L，生產強度為1.67 g/（L·h），轉化率為86.42%。

圖5 JH15利用稻草秸稈水解液發酵菌體生長、糖消耗和乳酸產量曲線

3 討論

國內外關于利用ptsG缺陷菌株進行混合糖發酵的研究已有報道。Nichols等［17］敲除了產乙醇大腸桿菌工程菌的ptsG基因，獲得的ptsG缺陷菌株能夠同時利用8%混合糖（葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）進行發酵，乙醇產率達到理論值87%-94%。嚴濤等［18］構建的ptsG缺陷菌株E.coli SZ470P在5%混合糖（2.5%木糖和2.5%葡萄糖）培養基中能同時利用葡萄糖和木糖進行發酵，木糖消耗量是對照菌株的3.8倍，乙醇產量提高了14.32%。但是關于同時利用五碳糖和六碳糖發酵產D-乳酸的文獻尚未見報道。

本實驗以能夠高效利用木糖產D-乳酸的重組大腸桿菌工程菌JH13為出發菌株，利用Red同源重組技術敲除ptsG基因，成功構建一株能夠同時利用五碳糖和六碳糖發酵產D-乳酸的工程菌E.coli JH15。在混合糖培養基中，在前24 h，JH15生長的比JH13緩慢，是因為敲除了葡萄糖跨膜轉運的主要基因ptsG，葡萄糖的攝取速度降低；24 h后JH15的菌體密度超過了JH13，是因為ptsG缺陷菌JH15降低了葡萄糖效應，在混合糖培養基中能更好的利用碳源來維持菌體的生長。在10%混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發酵中，JH15由于ptsG基因的敲除降低了葡萄糖效應，因此能夠完全利用葡萄糖和木糖，并且完成發酵，最終乳酸產量為83.04 g/L；對照菌株JH13先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完才利用木糖，發酵結束時還有18 g/L木糖殘留，乳酸產量為66.02 g/L。相比于對照菌，JH15木糖消耗速度提高了29.41%，乳酸產量提高了25.86%。因此ptsG基因的敲除能夠降低葡萄糖抑制效應，提高木糖的利用率，提高D-乳酸的產量。在稻草秸稈水解液發酵中，JH15同時利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖，15 h發酵結束，乳酸產量為25.15 g/L，轉化率為86.42%。稻草秸稈水解液發酵實驗進一步驗證了菌株JH15能夠很好的利用秸稈水解液發酵生產D-乳酸，為利用廉價的木質纖維素水解物為原料發酵生產D-乳酸提供參考依據。

4 結論

通過Red 同源重組技術敲除ptsG基因而成功構建的D-乳酸工程菌E.coli JH15，具有同時利用五碳糖和六碳糖發酵的能力。該菌經證實在10%的混合糖（5%葡萄糖和5%木糖）發酵過程中能有效的利用完葡萄糖和木糖，糖酸轉化率達到83.04%；并且能夠很好的利用稻草秸稈水解液發酵。

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（責任編輯李楠）

The Knockout of Gene ptsG of Recombinant Escherichia coli Producing D-lactic Acid and the Simultaneous Fermentation of Mixed Sugars

Ding Xiaoyun Gu Jianjian Wang Yongze Zhao Jinfang Wang Jinhua Zhao Xiao
（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068）

In order to construct a recombinant engineering Escherichia coli strain that yields D-lactic acid in the simultaneous efficient fermentation of pentose and hexose， having an engineering E. coli JH13 that efficiently ferment the pentose to produce D-lactic acid as an original strain， a glucose transmembrane transporter gene ptsG was knocked out by the technique of Red homologous recombination. The fermentative results showed that in the 10% mixed sugars（5% glucose and 5% xylose）， the ptsG-deleted strain E. coli JH15 simultaneously utilized pentose and hexose to complete the fermentation；however， the control strain started to utilize the xylose only after glucose was consumed up，and 18 g/L xylose still remained after the fermentation completed. The production of D-lactic acid by JH15 reached 83.04 g/L， and 25.86% higher than that by control strain JH13. The JH15 as a E. coli strain of producing D-lactic acid during simultaneous fermentation with mixed sugars， its construction provides a reference for producing the D-lactic acid in fermentation while utilizing the low-cost hydrolyzed components of lignocelluloses materials as raw material.

recombinant Escherichia coli；D-lactic acid；ptsG；Red homologous recombination；mixed sugars

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.032

2014-12-17

國家自然科學基金項目（NSFC31070094），湖北省自然科學基金項目（2011CDA008，2011CDB076），湖北工業大學博士科研啟動基金項目（BSQD12143）

丁小云，男，碩士研究生，研究方向：發酵工程；E-mail：858709213@qq.com

趙筱，女，博士，研究方向：生物質能源與生物質材料；E-mail：elaine82_82@hotmail.com