極端嗜熱微生物及其高溫適應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展

曾靜 郭建軍 邱小忠 王賢卓 袁林

（江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌　330096）

極端嗜熱微生物及其高溫適應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展

曾靜 郭建軍 邱小忠 王賢卓 袁林

（江西省科學(xué)院微生物研究所，南昌330096）

極端嗜熱微生物在高溫條件下生長(zhǎng)繁殖，其必然具有適應(yīng)高溫環(huán)境的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因類型以及生理生化機(jī)制。極端嗜熱微生物的研究對(duì)探索生命的起源以及極端嗜熱微生物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。對(duì)極端嗜熱微生物中細(xì)胞膜、核酸分子、蛋白質(zhì)分子、代謝產(chǎn)物和輔酶的高溫適應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，旨為極端嗜熱微生物以及來(lái)源于極端嗜熱微生物的各種生物分子的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

極端嗜熱微生物；熱穩(wěn)定性；高溫適應(yīng)機(jī)制

極端嗜熱微生物（Hyperthermophiles）是指最適生長(zhǎng)溫度在80℃以上的微生物［1］。與一般嗜熱微生物不同，極端嗜熱微生物在60℃以下會(huì)停止生長(zhǎng)，有的極端嗜熱微生物在90℃以下就會(huì)停止生長(zhǎng)［1］，如最高生長(zhǎng)溫度為113℃的極端嗜熱古生 菌Pyrolobus fumarii［2］。Stetter于1981年 分 離得到第一株極端嗜熱微生物，即熾熱甲烷嗜熱菌（Methanothermus fervidus），其最適生長(zhǎng)溫度為82℃，最高生長(zhǎng)溫度為97℃［3］。目前，人們已經(jīng)從高溫環(huán)境中分離得到90余種極端嗜熱微生物［1］。

極端嗜熱微生物具有獨(dú)特的基因類型、生理生化機(jī)制、代謝產(chǎn)物以及特殊的高溫適應(yīng)機(jī)制。目前關(guān)于極端嗜熱微生物的研究主要集中于極端嗜熱微生物的發(fā)現(xiàn)、適應(yīng)極端高溫環(huán)境的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，人們對(duì)來(lái)源于極端嗜熱微生物的各種生物分子，如極端嗜熱蛋白質(zhì)、相容性溶質(zhì)及代謝產(chǎn)物等也高度關(guān)注。這些研究有助于人們理解地球上生命的起源，為尋找其他可能存在生命的環(huán)境提供線索，同時(shí)也可以為生物技術(shù)以及相關(guān)的工業(yè)領(lǐng)域提供豐富的生物資源。

1 極端嗜熱微生物

1.1 極端嗜熱微生物的分布

極端嗜熱微生物分布于環(huán)境溫度高達(dá)80-115℃的高溫環(huán)境中，包括陸地高溫環(huán)境、海洋高溫環(huán)境及人造高溫環(huán)境［4］。陸地高溫環(huán)境包括火山噴氣孔、熱泉及含有石油的地?zé)釋拥取＿@類高溫環(huán)境中鹽濃度較低（0.1%-0.5%），環(huán)境pH變化范圍廣（pH 0-10）。海洋高溫環(huán)境包括淺海熱液系統(tǒng)、深海熱氣排氣口（又稱黑煙囪，Black Smokers）及活躍的海底山等。這類高溫環(huán)境中鹽濃度較高（3%），環(huán)境pH呈弱酸性至弱堿性（pH 5-8.5）。人造高溫環(huán)境包括發(fā)煙的煤矸石堆以及地?zé)岚l(fā)電廠和核電站的流出物等。高溫條件下氧氣的溶解度較低，并且高溫環(huán)境通常充滿還原性氣體，因此，除了暴露在空氣中的火山噴氣孔的表層外，極端嗜熱微生物所分布的高溫環(huán)境主要是缺氧的環(huán)境。值得注意的是，一些極端嗜熱微生物是從高于它們最高生長(zhǎng)溫度的高溫環(huán)境中分離得到的，如Hyperthermus butilicus和Pyrococcus abyssi；另外一些極端嗜熱微生物，如Archaeoglobus profundus則是從低于其最適生長(zhǎng)溫度的環(huán)境中分離得到的。這說(shuō)明，在原始生存環(huán)境中，極端嗜熱微生物可能并不處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)［5］。

1.2 極端嗜熱微生物的系統(tǒng)學(xué)分類

根據(jù)基于原核生物16S rRNA和真核生物18S rRNA序列分析所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，地球上所有生物分為細(xì)菌、古生菌和真核生物［6］。極端嗜熱微生物位于細(xì)菌和古生菌中。細(xì)菌中熱袍菌屬（Thermotoga）和產(chǎn)液菌屬（Aquifex）屬于極端嗜熱微生物，生長(zhǎng)溫度最高的極端嗜熱細(xì)菌是Thermotoga maritima和 Aquifex pyrophilus［5］。其中T. maritima的最高生長(zhǎng)溫度為90℃，最適生長(zhǎng)溫度為80℃；A. pyrophilus的最高生長(zhǎng)溫度為95℃，最適生長(zhǎng)溫度為85℃［1］。古生菌的泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、納古菌門(mén)（Nanoarchaeota）和初古菌門(mén)（Korarchaeota）中均分布有極端嗜熱微生物［1］。納古菌門(mén)中Nanoarchaeum equitans是目前已知的最小生物，它寄生在極端嗜熱古生菌Ignicoccus hospitalis的表面［7］。目前已知的生長(zhǎng)溫度最高的極端嗜熱古生菌分別來(lái)源于火裂片菌屬（Pyrolobus）、熱網(wǎng)菌科（Pyrodictiaceae）的Geogemma屬和甲烷火菌屬（Methanopyrus），如最高生長(zhǎng)溫度為113℃的P. fumarii［2］、最高生長(zhǎng)溫度為121℃的Geogemma barossii（Strain 121）［8］，以及生長(zhǎng)壓力為20 MPa時(shí)最高生長(zhǎng)溫度為122℃的Methanopyrus kandleri strain 116［9］。

極端嗜熱微生物位于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的根部，分支較短，且其生存的極端環(huán)境（如高溫、高壓、缺氧和充滿還原性氣體等）與生命起源時(shí)地球上的環(huán)境相似［10］，因此極端嗜熱微生物可能是與地球上所有生物的祖先最接近的生命形式。但是，這一推測(cè)與一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖［11］。例如，RNA分子在高溫條件下的穩(wěn)定性差；通過(guò)對(duì)來(lái)源于常溫微生物Escherichia coli 的DNA polymerase Ⅰ和來(lái)源于嗜熱微生物Thermus aquaticus的Taq polymerase的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Taq polymerase可能起源于常溫微生物，在適應(yīng)高溫環(huán)境的過(guò)程中，3'-5'核酸外切酶功能模塊中氨基酸殘基發(fā)生變化（如帶電荷氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基的數(shù)目增加），使其缺失3'-5'核酸外切酶活性。因此，有的學(xué)者認(rèn)為地球上最早的生命形式可能是常溫微生物。目前，關(guān)于地球上最早的生命形式的研究尚未有定論。有關(guān)極端嗜熱微生物的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生理生化性質(zhì)等的研究有利于人們對(duì)地球生命起源進(jìn)行深入探索。

1.3 極端嗜熱微生物的代謝類型

極端嗜熱微生物獲取能量的方式簡(jiǎn)單，其代謝類型分為化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型（Chemolithoautotrophic）和異養(yǎng)型（Heterotrophic）兩類。大多數(shù)極端嗜熱微生物屬于化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型微生物。化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型極端嗜熱微生物以CO2作為唯一碳源，通過(guò)有氧呼吸和厭氧呼吸來(lái)獲取能量［12］。化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型微生物通過(guò)還原性三羧酸循環(huán)（如A. pyrophilus和Thermoproteus neutrophilus）、還原性乙酰輔酶A途徑（如Archaeoglobus lithotrophicus）以及3-羥基丙酸循環(huán)（如Metallosphaera sedula、Sulfolobus metallicus及Acidianus infernus）這3種途徑來(lái)固定CO2。在呼吸作用中，H2是重要的電子供體，其他電子供體還包括硫化物、硫和亞鐵離子。有氧呼吸中，O2作為電子受體。進(jìn)行有氧呼吸的極端嗜熱微生物通常是微需氧微生物，能夠在氧氣濃度較低（＜10 ppm）的條件下生長(zhǎng)，如A. pyrophilus。根據(jù)厭氧呼吸中電子受體的不同，厭氧呼吸可以分為硝酸鹽呼吸、硫酸鹽呼吸、硫呼吸和二氧化碳呼吸等［12］。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中位于最根部，且分支最短的極端嗜熱微生物均為化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型（如Pyrolobus、Pyrodictium、Methanopyrus、Aquifex）。這些微生物是有機(jī)物的初級(jí)生產(chǎn)者，可以為異養(yǎng)型微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［12］。

一些化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型極端嗜熱微生物同時(shí)是兼性異養(yǎng)型，能夠利用環(huán)境中有機(jī)物（如死細(xì)胞）生長(zhǎng)，這些微生物主要屬于硫化葉菌屬（Sulfolobus）、生金球菌屬（Metallosphaera）、酸雙面菌屬（Acidianus）及熱棒菌屬（Pyrobaculum）［12］。異養(yǎng)型極端嗜熱微生物以有機(jī)物為碳源，通過(guò)呼吸作用（包括有氧呼吸和厭氧呼吸）或者發(fā)酵作用獲取能量［12］。異養(yǎng)型極端嗜熱微生物可以利用多肽混合物如蛋白胨或胰蛋白胨、酵母粉、碳水化合物以及有機(jī)化合物生長(zhǎng)。例如，熱火球古菌屬（Pyrococcus）的極端嗜熱古生菌可以利用多肽、纖維二糖、麥芽糖及丙酮酸等生長(zhǎng)［13］；熱袍菌屬（Thermotoga）的極端嗜熱細(xì)菌可以利用葡萄糖、淀粉及木聚糖等生長(zhǎng)［1］；從熱泉中分離得到的Acidilobus saccharovorans可以利用乙酸鹽、乳酸鹽及乙醇生長(zhǎng)［14］。

2 極端嗜熱微生物的高溫適應(yīng)機(jī)制

生物生長(zhǎng)的上限溫度很大程度取決于生物分子的熱穩(wěn)定性［5］。細(xì)胞在代謝途徑中所產(chǎn)生的一些小分子化合物和不耐熱的氨基酸在高溫條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生水解或分解。如當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí)，小分子化合物NAD+、ATP和ADP會(huì)發(fā)生水解，其中NAD+的半衰期少于10 min，ATP和ADP的半衰期約為1-6 h［15］。蛋白質(zhì)在高溫條件下易發(fā)生共價(jià)修飾作用（如天冬酰胺殘基和谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用、組氨酸殘基和半胱氨酸殘基的氧化作用等）而導(dǎo)致其失活和降解［15］。雖然這些生物分子在體外高溫條件下不穩(wěn)定，但其依然能在生長(zhǎng)溫度高達(dá)100-113℃的極端嗜熱微生物中發(fā)揮生理功能，說(shuō)明極端嗜熱微生物具有獨(dú)特的高溫適應(yīng)機(jī)制。

2.1 細(xì)胞膜的高溫適應(yīng)機(jī)制

極端嗜熱微生物包括極端嗜熱細(xì)菌和極端嗜熱古生菌。雖然細(xì)菌和古生菌的細(xì)胞膜的基本組分都是磷脂分子，但兩者的構(gòu)成相差較大［15］。如細(xì)菌中磷脂分子由含有16-18個(gè)碳原子的脂肪酸（疏水尾）通過(guò)酯鍵與甘油骨架（親水頭）的1，2碳位相連構(gòu)成，而古生菌中磷脂分子由類異戊二烯（疏水尾）通過(guò)醚鍵與甘油骨架（親水頭）的2，3碳位相連構(gòu)成；細(xì)菌的細(xì)胞膜是磷脂雙分子層膜，而古生菌的細(xì)胞膜是單分子層膜或單、雙分子層混合膜。因此，它們的細(xì)胞膜的高溫適應(yīng)機(jī)制有很大的區(qū)別。極端嗜熱細(xì)菌主要通過(guò)提高磷脂分子中飽和脂肪酸的比例、增加磷脂分子中磷脂酰烷基鏈的長(zhǎng)度以及提高異構(gòu)化支鏈的比例來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性［16］。飽和脂肪酸之間存在較強(qiáng)的疏水相互作用，可以增強(qiáng)細(xì)胞膜在高溫條件下的剛性，從而使其在高溫條件下更加穩(wěn)定。此外，一些極端嗜熱細(xì)菌的磷脂分子兼具有細(xì)菌和古生菌中磷脂分子的特征。例如，極端嗜熱細(xì)菌T. maritima的磷脂分子由含17個(gè)碳原子的脂肪酸通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連構(gòu)成［15］。

古生菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)包括雙植烷甘油二醚分 子（Diphytanylglycerol， 稱 為 Archaeols） 構(gòu)成的雙分子層膜結(jié)構(gòu)；雙植烷雙甘油四醚分子（Dibiphytanyldiglycerol，稱為caldarchaeols）（即雙植烷甘油二醚的二聚體形式）或雙植烷甘油諾尼醇四醚分子（Dibiphytanyl glycerol nonitol tetraethers，稱為Nonitolcaldarchaeols）構(gòu)成的單分子層膜結(jié)構(gòu)［17］。目前人們僅在嗜熱古生菌（包括極端嗜熱古生菌）中發(fā)現(xiàn)單分子層膜結(jié)構(gòu)，可能是由于單分子層膜結(jié)構(gòu)具有更高的機(jī)械強(qiáng)度。一些嗜熱古生菌［如熱原體目（Thermoplasmatales）］的細(xì)胞膜中雙植烷雙甘油四醚分子或雙植烷甘油諾尼醇四醚分子的每條C40雙植烷鏈含有0-4個(gè)環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)［18］。增加環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)的數(shù)量可進(jìn)一步提高細(xì)胞膜的機(jī)械強(qiáng)度，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性。此外，在嗜熱古生菌中，甘油骨架的C3位和諾尼醇分子的C6位存在糖基化修飾。親水頭所連接的糖基之間會(huì)形成氫鍵，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性［18］。

2.2 核酸分子的高溫適應(yīng)機(jī)制

極端嗜熱微生物胞內(nèi)的DNA反解旋酶、與DNA分子相結(jié)合的帶正電荷的蛋白質(zhì)、聚胺類物質(zhì)以及高濃度的鉀鹽是其胞內(nèi)DNA分子維持熱穩(wěn)定性的重要因素［16］。極端嗜熱微生物均含有一種特殊形式的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，即DNA反解旋酶（DNA reverse gyrase），它能夠促進(jìn)DNA分子形成正向超螺旋結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)DNA分子的熱穩(wěn)定性［16］。例如，極端嗜熱古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的野生型菌株能夠在100℃生長(zhǎng)，而缺失DNA反解旋酶基因的突變株（△rgy）在80℃以上生長(zhǎng)緩慢，且最高生長(zhǎng)溫度僅為93℃，這說(shuō)明DNA反解旋酶在維持高溫條件下DNA分子的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用［19］。廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）的部分極端嗜熱微生物含有類組蛋白（Histone-like proteins），它們能夠與雙鏈DNA分子結(jié)合，具有穩(wěn)定其雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用。T. kodakarensis KOD1含有兩種組蛋白（HpkA和HpkB），它們對(duì)于DNA分子的包裝和核小體的形成非常重要［16］。泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）的部分極端嗜熱微生物含有小分子DNA結(jié)合蛋白，如Sulfolobus acidocaldarius中小分子DNA結(jié)合蛋白Sac7d能夠與DNA分子結(jié)合，并有效地提高DNA分子的熔解溫度［20］。部分極端嗜熱微生物胞內(nèi)含有較高濃度的鉀鹽，有的極端嗜熱微生物胞內(nèi)的鉀離子濃度高達(dá)1 mol/L。部分極端嗜熱產(chǎn)甲烷菌（Hyperthermophilic methanogens）胞內(nèi)含有較高濃度的三鉀環(huán)-2，3-二磷酸甘油酯（Tripotassium cyclic-2，3-diphosphoglycerate）；極端嗜熱古生菌Pyrococcus woesei胞內(nèi)含有較高濃度的二肌醇-1，1'-磷酸鉀（Potassium di-inositol-1，1'-phosphate）［17］。鉀離子與DNA分子結(jié)合可以防止DNA分子在高溫條件下發(fā)生脫嘌呤作用。

古生菌的tRNA分子存在轉(zhuǎn)錄后修飾作用［15］。其所包含的經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核糖核苷酸包括：古嘌 苷archaeosine（7-formamidino-7-deazaguanosine）、m2Gm（N2，2'-O-dimethylguanosine）、m22Gm（N2，N2-O-trimethylguanosine）、m5s2U（5-methyl-2-thiouridine）等［16］。其中m2Gm和m22Gm這兩種核糖核苷酸是極端嗜熱古生菌tRNA分子所特有的。古生球菌屬（Archaeoglobus）、甲烷嗜熱菌屬（Methanothermu）、熱變形菌屬（Thermoproteus）、熱球菌屬（Thermococcus）、熱棒菌屬（Pyrobaculum）、熱網(wǎng)菌屬（Pyrodictium）及熱火球古菌屬（Pyrococcus）等極端嗜熱古生菌均含有這兩種核糖核苷酸分子［15］。

極端嗜熱微生物的rRNA分子主要通過(guò)與核糖體中蛋白質(zhì)組分的結(jié)合來(lái)提高熱穩(wěn)定性。極端嗜熱古生菌中rRNA分子的轉(zhuǎn)錄后修飾水平較低，但是rRNA分子中核糖核苷酸分子的甲基化修飾水平隨著極端嗜熱微生物的培養(yǎng)溫度的提高而有所升高，這說(shuō)明極端嗜熱古生菌中rRNA分子的甲基化修飾作用有利于其熱穩(wěn)定性的提高［15］。例如，S. solfataricus中16S rRNA和23S rRNA的甲基化修飾對(duì)于維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性非常重要［21］。

2.3 蛋白質(zhì)分子的高溫適應(yīng)機(jī)制

來(lái)源于極端嗜熱微生物的蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性。如來(lái)源于極端嗜熱古生菌Pyrococcus horikoshii的蛋白質(zhì)CutA1在環(huán)境pH為7.0的變性溫度Td（Denaturation temperature）高達(dá)148.5℃［22］；來(lái)源于極端嗜熱古生菌P. woesei的淀粉酶能夠在130℃發(fā)揮活性［23］。通過(guò)對(duì)同源的極端嗜熱蛋白質(zhì)（來(lái)源于極端嗜熱微生物）和常溫蛋白質(zhì)（來(lái)源于常溫微生物）的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，同源的極端嗜熱蛋白質(zhì)與常溫蛋白質(zhì)具有很高相似性［24］。以同源的極端嗜熱酶和常溫酶為例，兩者除了進(jìn)化上的差異以及維持穩(wěn)定性和發(fā)揮活性的溫度范圍不一致外，在一級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性。例如，極端嗜熱酶和常溫酶的氨基酸序列具有40%-85%的相似性；其三級(jí)結(jié)構(gòu)具有重疊性；它們具有相同的催化機(jī)理。因此極端嗜熱蛋白質(zhì)主要通過(guò)穩(wěn)定非保守結(jié)構(gòu)來(lái)提高整個(gè)分子的穩(wěn)定性。

極端嗜熱蛋白質(zhì)的高溫適應(yīng)機(jī)制涵蓋了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)到四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，而且極端嗜熱蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是由多種穩(wěn)定機(jī)制共同決定的，包括內(nèi)在因素和外在因素。極端嗜熱蛋白質(zhì)維持熱穩(wěn)定性的內(nèi)在因素包括如下：

2.3.1 氨基酸殘基的組成與分布。與常溫蛋白質(zhì)相比，極端嗜熱蛋白質(zhì)中帶電荷氨基酸殘基（Asp、Glu、Lys、Arg和His）的含量提高（增加3.24%），不帶電荷的極性氨基酸殘基（Ser、Thr、Asn和Gln）的含量降低（減少4.98%，其中Gln的含量減少了2.21%）［24］。另外，極端嗜熱蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸殘基和芳香族氨基酸殘基的含量也略有提高［24］。由于極端嗜熱微生物的基因組具有多樣性，極端嗜熱微生物中蛋白質(zhì)的氨基酸組成不一定完全符合上述規(guī)律。因此，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其氨基酸組成并不具有完全的相關(guān)性。更多的數(shù)據(jù)表明蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的分布以及氨基酸殘基之間的相互作用與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性具有更強(qiáng)的相關(guān)性。例如，同源的常溫蛋白酶subtilisin BPN’與嗜熱蛋白酶thermitase含有相同數(shù)量的帶電荷氨基酸殘基，但是thermitase含有更多的離子鍵［25］。

2.3.2 增強(qiáng)非共價(jià)作用力 如離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和芳香環(huán)相互作用等。以離子鍵為例，對(duì)比極端嗜熱蛋白質(zhì)和與其同源的常溫蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，極端嗜熱蛋白質(zhì)含有更多離子鍵（以及離子鍵網(wǎng)絡(luò)），這表明離子鍵（以及離子鍵網(wǎng)絡(luò)）對(duì)于極端嗜熱蛋白質(zhì)維持其熱穩(wěn)定性非常重要［26］。通過(guò)對(duì)分別來(lái)源于嗜冷微生物、常溫微生物和極端嗜熱微生物的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與離子鍵的數(shù)量及離子鍵網(wǎng)絡(luò)的大小呈正相關(guān)性［27］。

2.3.3 提高α-螺旋結(jié)構(gòu)（α-helix）的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)主要通過(guò)如下方式來(lái)提高α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性：肽鏈骨架結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基主鏈之間形成氫鍵；傾向于形成α-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基的含量提高，不利于α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氨基酸殘基（如Val、Ile和Thr）的含量降低；氨基酸殘基側(cè)鏈之間的相互作用（i，i+3；i，i+4）；α-螺旋結(jié)構(gòu)的N末端和C末端的極性氨基酸殘基與主鏈之間形成氫鍵；α-螺旋結(jié)構(gòu)的N末端和C末端附近的帶電荷氨基酸殘基（N末端附近含有帶負(fù)電荷的氨基酸殘基、C末端附近含有帶正電荷的氨基酸殘基）與螺旋偶極子（helix macrodipole）之間的靜電作用［28］。

2.3.4 減少溶劑可及的疏水表面 蛋白質(zhì)分子表面的疏水性氨基酸殘基傾向于遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)周圍的水分子，不與溶劑產(chǎn)生相互作用，蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基的分布不利于其穩(wěn)定性和溶解性［26］。許多極端嗜熱蛋白質(zhì)通過(guò)減少溶劑可及的疏水表面來(lái)提高熱穩(wěn)定性，如來(lái)源于T. kodakarensis的核糖核酸酶HII（Tk-Rnase HII）［29］等。

2.3.5 多肽鏈N末端和C末端的對(duì)接及松散末端的固定 蛋白質(zhì)中l(wèi)oop結(jié)構(gòu)、N末端及C末端是其分子結(jié)構(gòu)中具有較強(qiáng)多變性的區(qū)域。在蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性的過(guò)程中，這些區(qū)域會(huì)首先出現(xiàn)解折疊現(xiàn)象［24］。一些極端嗜熱蛋白質(zhì)通過(guò)修飾這些熱不穩(wěn)定的區(qū)域獲得較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。其中l(wèi)oop結(jié)構(gòu)的修飾包括以下兩個(gè)方面：縮短loop結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度；將loop結(jié)構(gòu)固定在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的其他區(qū)域上［15］。極端嗜熱蛋白質(zhì)主要通過(guò)延長(zhǎng)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)或引入新的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)縮短loop結(jié)構(gòu)，如來(lái)源于極端嗜熱古生菌Vulcanisaeta moutnovskia的內(nèi)酯酶（Vmo Lac）即通過(guò)引入額外的α-helix來(lái)縮短loop結(jié)構(gòu)［30］。Loop結(jié)構(gòu)的固定主要是通過(guò)離子鍵、氫鍵和疏水相互作用完成。蛋白質(zhì)的N末端和C末端也通過(guò)與loop結(jié)構(gòu)類似的方式固定在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的其他區(qū)域［24］，如來(lái)源于T. maritima的鐵氧化還原蛋白（Ferredoxin）的N末端通過(guò)氫鍵固定在蛋白質(zhì)的核心區(qū)域［31］。

2.3.6 結(jié)合金屬離子。金屬離子的結(jié)合與酶分子的活性和穩(wěn)定性相關(guān)，例如來(lái)源于Pyrococcus furiosus的胞外α-淀粉酶的活性和穩(wěn)定性與其結(jié)合的Ca2+和Zn2+相關(guān)［32］。Zeng等［33］對(duì)來(lái)源于P. furiosus的極端嗜熱蛋白酶pyrolysin的高溫適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明pyrolysin含有兩個(gè)與其熱穩(wěn)定性密切相關(guān)的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。

2.3.7 蛋白質(zhì)亞基之間的相互作用和多聚化。已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明亞基之間的相互作用可以影響極端嗜熱蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。例如，來(lái)源于極端嗜熱古生菌P. abyssi的tRNA m1A57/58甲基轉(zhuǎn)移酶（tRNA m1A57/58 methyltransferase，PabTrml）以四聚體的形式存在。在四聚體結(jié)構(gòu)中，不同亞基的半胱氨酸殘基Cys196和Cys233之間相互形成了4對(duì)二硫鍵。野生型與突變體C196S/C233S的Tm值分別為105.3℃和88.8℃，即亞基間二硫鍵的去除導(dǎo)致該酶分子的熱穩(wěn)定性下降，這說(shuō)明亞基間的二硫鍵對(duì)于PabTrml的熱穩(wěn)定性非常重要［34］。與同源的常溫蛋白質(zhì)相比，許多極端嗜熱蛋白質(zhì)的寡聚化程度更高。極端嗜熱蛋白質(zhì)的寡聚化結(jié)構(gòu)也與其穩(wěn)定性相關(guān)。如來(lái)源于常溫微生物的甲川四氫甲烷喋呤環(huán)水解酶（methenyl-tetrahydromethanopterin cyclohydrolase）以二聚體的形式存在，而來(lái)源于極端嗜熱古生菌Methanopyrus kandleri的甲川四氫甲烷喋呤環(huán)水解酶（Mch）以三聚體的形式存在［35］。

2.3.8 翻譯后修飾 翻譯后修飾現(xiàn)象廣泛地存在于極端嗜熱微生物中。極端嗜熱蛋白質(zhì)的翻譯后修飾包括糖基化（Glycosylation）、磷酸化（Phosphorylation）、甲基化（Methylation）等［36］。與從原始菌中分離得到的天然蛋白質(zhì)相比，一些異源表達(dá)（如在E. coli中進(jìn)行表達(dá)）得到的重組極端嗜熱蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較差，這可能與天然蛋白質(zhì)的翻譯后修飾相關(guān)。例如，來(lái)源于P. furiosus的極端嗜熱蛋白酶pyrolysin是一種與細(xì)胞膜組分結(jié)合的糖基化蛋白酶［37］。Pyrolysin具有較好的熱穩(wěn)定性，在95℃的半衰期為9 h，而大腸桿菌中表達(dá)的重組pyrolysin在95℃的半衰期僅為2.5 h［37］。這兩種酶分子的熱穩(wěn)定性差異可能與pyrolysin的糖基化修飾相關(guān)。

極端嗜熱微生物胞內(nèi)的環(huán)境因子（如相容性溶質(zhì)、分子伴侶蛋白等）及細(xì)胞組成成分（如S層）可以作為外在因素來(lái)維持極端嗜熱蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。極端嗜熱微生物胞內(nèi)的相容性溶質(zhì)（如環(huán)2，3-二磷酸甘油酸、磷酸二肌醇、甘露糖基甘油酸等）、分子伴侶蛋白等，可以輔助蛋白質(zhì)維持其熱穩(wěn)定性［38］。例如，熾熱甲烷嗜熱菌（M. fervidus）胞內(nèi)環(huán)2，3-二磷酸甘油酸（Cyclic 2，3-diphosphoglycerate，cDPG）的濃度隨其培養(yǎng)溫度的提高而升高，并且cDPG可以明顯提高M(jìn). fervidus中甘油醛-3-磷酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性［39］。分子伴侶蛋白能夠與熱變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，防止熱變性的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，并能輔助它們折疊形成正確的構(gòu)象。極端嗜熱古生菌T. kodakarensis KOD1含有兩類分子伴侶蛋白CpkA和CpkB，它們分別在其生長(zhǎng)溫度過(guò)低和生長(zhǎng)溫度過(guò)高的情況下表達(dá)并發(fā)揮功能［16］。一些極端嗜熱微生物細(xì)胞表面的S層可以作為胞外酶的附著位點(diǎn)，如極端嗜熱古生菌Staphylothermus marinus中存在附著于S層的胞外絲氨酸蛋白酶STABLE，與S層的結(jié)合可以提高STABLE的熱穩(wěn)定性［40］。

2.4 代謝產(chǎn)物和輔酶的高溫適應(yīng)機(jī)制

代謝途徑中許多重要的中間代謝產(chǎn)物和輔酶在高溫條件下的穩(wěn)定性較差。極端嗜熱微生物通過(guò)快速合成或替換熱穩(wěn)定性較差的代謝產(chǎn)物（或輔酶）、提高酶分子的催化效率以及一些特殊的保護(hù)機(jī)制來(lái)維持其在高溫條件下的正常代謝活動(dòng)［15］。極端嗜熱微生物中代謝產(chǎn)物和輔酶的高溫適應(yīng)機(jī)制主要包括以下4種［15］。

2.4.1 微環(huán)境保護(hù)作用（Microenvironment protection）許多輔酶的熱穩(wěn)定性依賴于其所處的環(huán)境。如ATP的熱穩(wěn)定性與環(huán)境pH及金屬離子相關(guān)；在高pH條件下，NADH具有較高的熱穩(wěn)定性。ATP和NAD+能在生長(zhǎng)溫度高達(dá)100℃以上的極端嗜熱微生物中發(fā)揮生理功能，說(shuō)明這些極端嗜熱微生物中可能存在有利于其維持較高熱穩(wěn)定性的微環(huán)境。

2.4.2 代謝通路（Metabolic channeling） 同一代謝途徑中參與反應(yīng)的酶分子按照特定的順序發(fā)揮作用。在一些極端嗜熱微生物中，對(duì)熱不穩(wěn)定的中間代謝產(chǎn)物由上游酶分子迅速轉(zhuǎn)移至與上游酶分子并列排布的下游酶分子，這樣有利于極端嗜熱微生物克服因中間代謝產(chǎn)物的不穩(wěn)定性對(duì)代謝過(guò)程產(chǎn)生的不利影響。氨甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate，CP）是精氨酸合成途徑和嘧啶合成途徑中重要的中間代謝產(chǎn)物，但氨甲酰磷酸100℃時(shí)穩(wěn)定性較差（100℃的半衰期＜2 s）。極端嗜熱古生菌P. abyssi中氨甲酰磷酸合成酶與其下游的天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（Aspartate carbamoyltransferase，ATCase）在空間上并列排布，構(gòu)成氨甲酰磷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)通道，從而保護(hù)氨甲酰磷酸，也使代謝反應(yīng)正常進(jìn)行［41］。

2.4.3 提高酶分子的催化效率（Catalytic efficiency）Sterner等［42］關(guān)于極端嗜熱細(xì)菌T. maritima中色氨酸合成途徑的研究表明，來(lái)源于T. maritima的磷酸核糖鄰氨基苯甲酸鹽異構(gòu)酶（Phosphoribosyl anthranilate isomerase，Tprai）具有較高的催化活性（Km值降低，kcat值升高），能夠克服對(duì)熱不穩(wěn)定的磷酸核糖鄰氨基苯甲酸鹽（80℃時(shí)半衰期為39 s）對(duì)色氨酸合成所造成的不利影響。

2.4.4 對(duì)熱不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物或輔酶的替換或缺失（Substitution or deletion） 一些極端嗜熱微生物通過(guò)替換代謝途徑或采用熱穩(wěn)定性較好的中間代謝產(chǎn)物或輔酶來(lái)適應(yīng)高溫環(huán)境。例如，極端嗜熱古生菌P. furiosus通過(guò)一種非磷酸化的ED途徑（Entner-Doudoroff pathway）來(lái)完成糖酵解過(guò)程。在這種代謝途徑中，非血紅素鐵蛋白（Non-haem iron proteins）替代輔酶NAD（P）發(fā)揮功能［43］。

3 展望

極端嗜熱微生物對(duì)高溫環(huán)境的良好的適應(yīng)性來(lái)源于極端嗜熱微生物的生物大分子，如蛋白質(zhì)、磷脂分子等對(duì)高溫環(huán)境具有良好的耐受能力，因此其在科研及多種生產(chǎn)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值［44］。例如，極端嗜熱微生物直接應(yīng)用于生物能源、生物冶金及環(huán)境的生物修復(fù)等領(lǐng)域；極端嗜熱酶除具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫催化活性外，還對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑及變性劑等有較強(qiáng)的耐受性，因此其能夠克服工業(yè)生產(chǎn)中苛刻的反應(yīng)條件對(duì)酶分子應(yīng)用的限制。此外，極端嗜熱微生物中遺傳操作系統(tǒng)的建立以及極端嗜熱酶在常溫宿主中的異源表達(dá)拓展了其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。但是極端嗜熱微生物的采集和培養(yǎng)需要特殊的設(shè)備和條件，這一特點(diǎn)導(dǎo)致其研究和工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)度緩慢，因此極端嗜熱微生物及其特殊的高溫適應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究開(kāi)發(fā)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances on Hyperthermophiles and M echanism of Their Thermal Adaptation

Zeng Jing Guo Jianjun Qiu Xiaozhong Wang Xianzhuo Yuan Lin
（Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang330096）

Hyperthermophiles are able to grow and reproduce at high temperatures， and inevitably they should have special cellular features， genome sequences and physiological properties to adapt to high temperatures. The researches on hyperthermophiles possess significances for exploring the origin of life on Earth， and the developments and applications of hyperthermophiles. The recent advances on the thermal adaptation of cellular components of hyperthermophiles（cell membranes， nucleic acids， proteins， metabolites and cofactors）are summarized， which may provide the theoretical basis for the developments and applications of hyperthermophiles and their cellular components.

hyperthermophiles；thermo-stability；thermal adaptation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.005

2015-01-15

江西省科研院所基礎(chǔ)設(shè)施配套項(xiàng)目（20142BBA13030），江西省重點(diǎn)科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化計(jì)劃（20142BBI90041），江西省科技廳青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20151BAB214001），江西省科學(xué)院科研開(kāi)發(fā)專項(xiàng)博士項(xiàng)目（2014-YYB-08）

曾靜，女，博士，研究方向：極端嗜熱蛋白酶的高溫適應(yīng)性機(jī)制；E-mail：zengjingwhu@126.com

袁林，男，博士，研究方向：工業(yè)微生物的應(yīng)用；E-mail：yuanlin2003cn@aliyun.com