響應面法優化魷魚(Ommastrephes bartrami)皮膠原蛋白提取液脫色工藝*

張　雪　令狐青青　童曉倩　毛貴珠　羅紅宇　宋　茹

(浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室　浙江海洋學院食品與醫藥學院　舟山　316022)

魷魚(Ommastrephes bartrami)屬海洋頭足類, 無脊椎軟體動物, 富含蛋白質、脂肪、礦物質及維生素等多種營養成分, 是我國一種非常重要的水產品加工原料。魷魚在加工過程中大約產生 15%—30%的頭、足、內臟及表皮等廢棄物, 其中魷魚皮約占廢棄物總量的 8%—10%, 主要由結構蛋白——膠原蛋白組成(郭無瑕等, 2006)。以往膠原蛋白的提取主要從陸地動物的皮、骨、筋腱中獲得, 但是近年來由于一些人畜共患病爆發, 如: 瘋牛病、禽流感、口蹄疫等,陸地動物源膠原蛋白的安全性引發公眾關注。相比之下, 海洋動物源膠原蛋白則具有更高的安全性, 魷魚皮中膠原蛋白除了可以直接食用外, 還富含甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸, 對皮膚有良好的修復和滋養作用。此外, 國內外大量研究還報道魷魚皮膠原蛋白水解液具有抗氧化、降血壓、調血脂、提高免疫力等生理活性(劉克海等, 2008; Giménezet al, 2009; Alemánet al, 2011, 2013; Gómez-Guillénet al, 2011; LINet al,2012; Veerurajet al, 2015)。

膠原蛋白可以采用酸法、堿法和酶法提取, 但是顏色較深的膠原蛋白提取液需要經過適宜的脫色處理才能進一步應用。蛋白質及其水解液的脫色主要采用化學法和物理法, 化學脫色法因為加入氧化型或還原型化學試劑, 所以對脫色液中各組分理化性質影響大, 而且也存在安全隱患。物理脫色法主要通過吸附作用完成, 因此對脫色液性質影響小, 安全性高。活性炭吸附法是一種常用的物理脫色法, 具有吸附效果好、成本低, 且對樣品液影響小等優點, 因此廣泛被用于食品中蛋白液、糖漿、醬油等脫色處理(Sessaet al, 2008; 孫玉軍等, 2012; 周統武等, 2013;謝建華等, 2013; Miyagiet al, 2013)。在前期研究中,用酸法提取的魷魚皮膠原蛋白提取液為紅棕色, 本文選擇粉末活性炭為吸附劑, 研究吸附條件對魷魚皮膠原蛋白提取液脫色效果影響, 然后采用響應面分析法優化活性炭吸附脫色條件, 并分析脫色后魷魚皮膠原蛋白提取液的蛋白質含量及氨基酸組成變化, 旨在為魷魚皮膠原蛋白的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

魷魚皮由浙江省舟山市富丹旅游食品有限公司提供; 粉末活性炭購于上海國藥化學試劑集團; 正丁醇(食用級); 其余試劑均為國產分析純。

1.2　主要儀器設備

CU420型電熱恒溫水浴鍋, 上海棱光技術有限公司; 721G型可見分光光度計, 上海精密科學儀器有限公司; TGL-16C型高速離心機, 上海安亭科學儀器廠; CH-420型電熱恒溫水槽, 上海一恒科技有限公司;L-8900型氨基酸分析儀, 日本日立公司。

1.3　試驗方法

1.3.1魷魚皮膠原蛋白提取液的制備冷凍保藏的魷魚皮先用流動水解凍, 清洗干凈后切碎, 加入10%正丁醇浸沒魚皮, 4°C下萃取24 h除去脂類, 將脫脂的魚皮用蒸餾水沖洗干凈。根據魚皮質量, 按照1︰6 (W:V)比例加入0.05 mol/L NaOH, 室溫浸泡60 min,充分溶脹魚皮后用蒸餾水洗至中性, 再按照魚皮質量以1︰5 (W:V)比例加入0.5 mol/L冰醋酸, 勻漿,將勻漿液在 40°C恒溫水浴攪拌器中抽提 6 h, 然后4000 r/min離心20 min, 棄去不溶物, 得到顏色發紅的魷魚皮膠原蛋白提取液, 經旋轉蒸發濃縮后置于4°C 冷藏, 備用。

1.3.2魷魚皮膠原蛋白提取液中色素特征吸收波長魷魚皮膠原蛋白提取液呈紅棕色, 說明在可見光區有特征吸收。將魷魚皮膠原蛋白濃縮液用0.5 mol/L的冰醋酸適當稀釋, 然后在400—800 nm進行可見光譜掃描。

1.3.3活性炭吸附影響因素采用活性炭吸附法對魷魚皮膠原蛋白提取液進行脫色, 在前期研究中發現粉末型活性炭對魷魚皮膠原蛋白提取液中色素吸附效果好于顆粒型活性炭。所以, 本研究采用粉末型活性炭為吸附劑, 分別研究活性炭添加量(1.0%—8.0%)、脫色時間(10—70 min)、溶液pH值(2.4—7.4)和脫色溫度(10—40°C)對魷魚皮膠原蛋白提取液脫色效果影響。

1.3.4活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白提取液色素條件優化在研究活性炭對魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除效果的基礎上, 選擇活性炭用量、膠原蛋白提取液pH值和脫色溫度進行三因素三水平的響應面分析Box-Behnken中心組合試驗, 試驗因素水平及編碼值見表1, 特征波長下膠原蛋白提取液色素的吸光值為響應值, 采用Design Expert Software (version 7.1.4,USA)軟件對結果進行Quadratic模型擬合:

式中,y表示響應值,Xi和Xj代表因素水平,β0、βj、βjj和βij分別表示常數項、一次項、二次項和交互項系數。

1.3.5蛋白質含量測定考馬斯亮藍法(Bradford,1976), 牛血清白蛋白為標準品。

1.3.6氨基酸組成分析取凍干樣品適量, 加入15 mL的6 mol/L HCl溶解, 在110°C下氮氣保護水解22 h, 冷卻后轉移至25 mL容量瓶中定容。取1 mL水解液用55°C氮氣吹干, 加入1 mL蒸餾水再烘干,反復 3次, 再用 0.02 mol/L HCl溶解定容至 1 mL,0.45μm濾膜過濾, 取濾液 20μL上 L-8900型氨基酸分析儀測定。

1.4　數據統計分析

魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除結果用平均值±標準差表示(n=2),P＜0.05表示差異顯著。

2　結果與討論

2.1　魷魚皮膠原蛋白提取液色素特征吸收波長

如圖1所示, 魷魚皮膠原蛋白提取液在 400—450 nm有一個非常明顯的吸收峰, 經測定確定魷魚皮膠原蛋白提取液中色素的特征吸收波長為420 nm(圖1b)。

圖1　魷魚皮膠原蛋白提取液可見吸光光譜Fig.1　The absorbance spectrum of collagen extract from squid skin

2.2　魷魚皮膠原蛋白提取液脫色條件

活性炭對色素類具有良好的吸附作用, 前期研究中發現粉末活性炭的脫色效果好于顆粒活性炭。所以采用粉末活性炭為吸附劑, 分別研究活性炭添加量、脫色時間、吸附pH值和脫色溫度對魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除影響, 結果見圖2。

圖2　各因素對魷魚皮膠原蛋白提取液色素脫除影響Fig.2　Effects of each factor on the decoloring of collagen extract from squid skin

粉末活性炭具有多孔結構, 適當地加大活性炭用量能提高對色素的物理性吸附作用, 但是當吸附達到飽和時, 加大活性炭用量并不能有效提高色素的脫除效果(陳荔紅等, 2009)。從圖2a可以看出, 隨著活性炭用量的增加, 魷魚皮膠原蛋白液在 420 nm處吸光值逐漸地降低, 在活性炭添加量 4.0%時脫色液的吸光值最低。當活性炭添加量大于5.2%時, 脫色液的吸光值反而略有增加, 說明此時活性炭吸附已經達到飽和, 而且添加過多粉末活性炭也不利于后續離心分離, 而脫色液中殘留的活性炭粉末會造成吸光值的增加。

由圖2b可知, 延長脫色時間有助于活性炭與色素分子的充分接觸, 從而提高吸附效果。當脫色時間為 30 min時, 魷魚皮膠原蛋白脫色液的吸光值最低, 而后增加脫色時間并沒有進一步地提高脫色效果。

圖2c結果顯示, 在偏酸性pH值下, 活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液中色素效果好, 而在 pH值為 7.4時, 脫色液在 420 nm處吸光值劇烈增加, 說明該條件下活性炭吸附色素能力急劇降低。

從圖2d可以看出, 脫色溫度在10—35°C時, 活性炭的脫色效果隨著脫色溫度的升高而逐漸地增強,說明活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液中色素應是一個吸熱過程, 脫色溫度的提高有助于增加活性炭顆粒能量, 結果提高了與色素分子碰撞幾率, 從而提高脫色作用。此外, 適當地提高吸附溫度也有利于降低魷魚皮膠原蛋白液的黏度, 減少與活性炭分子間作用阻力, 有助于提高吸附作用。當脫色溫度大于 35°C時, 魷魚皮膠原蛋白脫色液在420 nm處吸光值又開始上升, 可能與色素在較高溫度下從活性炭上解吸有關(陳荔紅等, 2009)。

2.3　魷魚皮膠原蛋白提取液脫色工藝優化

因為活性炭對氨基酸、肽、蛋白質等有吸附作用,而動物蛋白色素常與蛋白質結合在一起, 所以為了盡量降低蛋白質損耗率, 吸附作用應控制在短時內完成。由圖2b結果可知, 脫色時間為30 min時, 活性炭對魷魚皮膠原蛋白液的脫色作用基本完全, 所以選擇活性炭添加量、溶液pH值和脫色溫度做響應面分析試驗進一步優化脫色條件, 具體因素編碼值和實際值見表1, 試驗安排和結果見表2。

表1　響應面分析Box-Behnken中心組合試驗因素編碼值和實際值Tab.1　Experimental code and corresponding real values in the Box-Behnken design of response surface method

表2　響應面分析Box-Behnken中心組合試驗安排和結果Tab.2　Experimental design and results of Box-Behnken response surface method

根據表2中數據進行Quadratic回歸方差模型擬合, 得到活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白提取液中色素方程為:

對模型擬合結果進行方差分析, 結果見表3。

表3方差分析結果顯示模型P值小于0.0001, 表明該模型極顯著(P＜0.01), 且相關系數R2= 0.9783,說明各因素值和響應值之間的關系可以用 Quadratic模型進行函數化, 實驗確定的回歸方程能夠代替真實點的預測結果。當P＜0.05時, 因素對結果影響顯著, 由此可以看出表3中各因素一次項、交互項和二次項對響應值均有顯著性影響。在脫色時間為30 min條件下, 表2數據經 Quadratic回歸模型擬合得到活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液色素最佳條件為: 活性炭添加量 4.2%, 膠原蛋白液 pH值 2.27, 脫色溫度35°C。魷魚皮膠原蛋白提取液在該條件下脫色后理論特征吸光值(OD420nm)為 0.854, 經驗證脫色后魷魚皮膠原蛋白液的實際特征吸光值為 0.839, 與理論值一致, 色素脫除率為45.6%。

活性炭添加量和pH值(x1x2)、活性炭添加量和脫色溫度(x1x3)和 pH 值和脫色溫度(x2x3)的交互作用與魷魚皮膠原蛋白液色素脫除效果關系, 結果見圖3。

從圖3a能夠看出, 魷魚皮膠原蛋白提取液中色素脫除效果總體趨勢是隨著活性炭添加量的增加而逐漸地增強, 即: 420 nm下特征吸光值逐漸地降低。特別是在pH 2.6—2.0時, 吸光值下降趨勢更為明顯,說明活性炭用量對提取液色素脫除具有線性影響。當pH值3.0時, 活性炭添加量對膠原蛋白液中色素脫除效果影響平緩。而且粉末活性炭添加量過大時, 有一些粉末活性炭會漂浮在提取液表面, 后面的離心處理也很難再除去, 所以未考查活性炭添加量大于4.8%時對膠原蛋白液的脫色效果。

圖3b顯示, 在相對較低脫色溫度25°C時, 活性炭添加量的加大對膠原蛋白液色素的脫除影響不明顯, 表現為膠原蛋白液吸光值變化平緩。同樣, 當活性炭添加量較低時, 如: 3.6%, 脫色溫度對膠原蛋白液中色素脫除影響平緩。而當活性炭添加量為 4.8%時, 魷魚皮膠原蛋白液色素的脫除隨著脫色溫度的升高而增強。由此可以判定活性炭添加量和脫色溫度在實驗設定的較高水平時對膠原蛋白液色素脫除影響顯著, 因脫色溫度大于 35°C不利于魷魚皮膠原蛋白液色素的脫除(見圖2d結果), 所以圖3b未考查脫色溫度大于35°C情況。

由圖3c可知, 魷魚皮膠原蛋白液的pH值為2.4—3.0時, 提高脫色溫度有利于活性炭吸附色素, 但當 pH值小于 2.4時, 脫色溫度對膠原蛋白提取液色素的脫除影響比較平緩。

2.4　蛋白質含量和氨基酸組成分析

測定優化條件下活性炭吸附魷魚皮膠原蛋白液色素后蛋白質含量, 分析氨基酸組成變化, 未脫色樣品為對照, 具體結果分別見圖4和表4。

圖4　魷魚皮膠原蛋白提取液的蛋白質含量變化Fig.4　Changes in protein content of collagen extract from squid skin

活性炭對色素類物質的吸附具有非特異性, 在吸附色素時, 溶液中蛋白質、肽以及氨基酸類也同時被吸附(Sessaet al, 2008)。徐曼等(2013)用粉末活性炭對豆粕蛋白酶解液進行脫色處理, 結果發現最優脫色條件下(溶液 pH 4.0, 粉末活性炭用量 0.6%, 脫色溫度 50°C, 吸附時間 50min), 豆粕蛋白酶解液肽的損失率為24.96%。章紹兵等(2011)報道粉末活性炭對花生蛋白酶解液脫色(溶液 pH 3.2, 活性炭用量 8%,吸附溫度55°C, 吸附時間30min)后蛋白損失20.86%。上述文獻報道雖然活性炭吸附條件不同, 但是脫色液中蛋白質及肽類損耗在20%左右。圖4中魷魚皮膠原蛋白液的蛋白質含量由脫色前 890.26μg/mL降至脫色后715.27μg/mL (P＜0.05), 蛋白質損失率為19.65%, 與上述文獻報道結果一致。

由表4氨基酸分析結果可知, 魷魚皮膠原蛋白提取液的氨基酸總量由脫色前765.72 mg/g降至脫色后590.16 mg/g, 損耗率為22.93%, 略高于圖4蛋白質損耗率。甘氨酸含量無論是脫色前(175.67 mg/mL,22.94%)還是脫色后(136.02 mg/g, 23.05%)均最高, 谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸含量也較高, 而酪氨酸和組氨酸含量較低, 符合水產膠原蛋白氨基酸和I型膠原蛋白氨基酸特點(李八方等, 2013; 侯虎等,2013; 夏珊珊等, 2014)。此外, 魷魚皮膠原蛋白液中蛋氨酸和半胱氨酸總量不到 1%, 與膠原蛋白幾乎不含有含硫氨基酸報道一致(李八方等, 2013)。表4結果顯示活性炭脫色后, 魷魚皮膠原蛋白提取液的半胱氨酸含量增加了一倍, 應與酸性條件下活性炭吸附促進蛋氨酸轉化為半胱氨酸有關。脫色液中一些氨基酸, 如: 異亮氨酸、天冬氨酸、組氨酸、亮氨酸和賴氨酸的損耗率要高于其它氨基酸, 可能與活性炭吸附的蛋白質或色素蛋白中這幾種氨基酸含量相對較高, 或者與活性炭直接吸附這些游離氨基酸有關。

表4　魷魚皮膠原蛋白提取液的氨基酸組成分析Tab.4　Amino acid analysis for collagen extract from squid skin

3　結論

活性炭吸附法能有效減少魷魚皮膠原蛋白提取液的色素值, 當脫色時間為30 min時, 經響應面分析得到活性炭最佳脫色條件為: 活性炭添加量 4.2%,溶液pH 2.27, 脫色溫度35°C。在最優條件下, 魷魚皮膠原蛋白提取液的脫色率為45.6%, 蛋白質和氨基酸損耗率在20%左右。氨基酸分析顯示脫色后的魷魚皮膠原蛋白具有水產膠原蛋白氨基酸和I型膠原蛋白氨基酸特點。但是, 如何利用被活性炭吸附的蛋白質或氨基酸, 還有待進一步深入研究。

劉克海, 秦玉青, 徐海波等, 2008. 魷魚皮膠原蛋白的提取及在化妝品中的應用. 水產科學, 27(8): 411—413

孫玉軍, 李正鵬, 2012. 羊肚菌胞外多糖活性炭脫色工藝. 中國醫院藥學雜志, 32(23): 1885—1888

李八方, 郭鳴, 侯虎等, 2013. 胡子鯰魚皮酸溶性膠原蛋白的理化性質研究. 現代食品科技, 29(11): 2580—2585

陳荔紅, 鄭寶東, 2009. 仙草膠提取液脫色工藝的研究Ⅱ——活性炭. 中國農學通報, 25(17): 36—40

周統武, 梁志堅, 吳天秀等, 2013. 熟地多糖活性炭脫色工藝的研究. 天然產物研究與開發, 25(7): 972—975, 994

侯虎, 孫江, 毛家楠等, 2013. 海參膠原纖維形態及膠原蛋白理化性質研究. 現代食品科技, 29(7): 1491—1495

夏珊珊, 曹少謙, 劉亮等, 2014. 響應面法優化馬面魚皮膠原蛋白提取工藝及膠原組成分析. 核農學報, (5): 869—875

徐曼, 馬寒冰, 李錚等, 2013. 粉末活性炭脫色豆粕蛋白酶解液的條件優化. 食品工業科技, 34(11): 263—266

郭無瑕, 胡建恩, 王秀武等, 2006. 魷魚副產物的綜合利用.精細與專用化學品, 14(18): 6—8

章紹兵, 甘曉露, 龔琴, 2011. 花生蛋白酶解液的活性炭脫色工藝研究. 河南工業大學學報(自然科學版), 32(2): 10—14

謝建華, 申明月, 聶少平等, 2013. 青錢柳多糖活性炭脫色工藝. 南昌大學學報(理科版), 37(4): 382—385

Alemán A, Gómez-Guillén M C, Montero P, 2013. Identification of ACE-inhibitory peptides from squid skin collagen afterin vitrogastrointestinal digestion. Food Research International,54(1): 790—795

Alemán A, Pérez-Santín E, Bordenave-Juchereau Set al, 2011.Squid gelatin hydrolysates with antihypertensive, anticancer and antioxidant activity. Food Research International, 44(4):1044—1051

Bradford M M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding. Analytical Biochemistry, 72:248—254

Gómez-Guillén M C, Montero M P, 2011. Contribution of Leu and Hyp residues to antioxidant and ACE-inhibitory activities of peptide sequences isolated from squid gelatin hydrolysate.Food Chemistry, 125(2): 334—341

Giménez B, Gómez-Estaca J, Alemán Aet al, 2009. Improvement of the antioxidant properties of squid skin gelatin films by the addition of hydrolysates from squid gelatin. Food Hydrocolloids, 23(5): 1322—1327

LIN Lin, LV Shun, LI Ba-fang, 2012. Angiotensin-I-converting enzyme (ACE)-inhibitory and antihypertensive properties of squid skin gelatin hydrolysates. Food Chemistry, 131(1):225—230

Miyagi A, Nabetani H, Nakajima M, 2013. Decolorization of Japanese soy sauce (shoyu) using adsorption. Journal of Food Engineering, 116: 749—757

Sessa D J, Palmquist D E, 2008. Effect of heat on the adsorption capacity of an activated carbon for decolorizing/deodorizing yellow zein. Bioresource Technology, 99: 6360—6364

Veeruraj A, Arumugam M, Ajithkumar Tet al, 2015. Isolation and characterization of collagen from the outer skin of squid(Doryteuthis singhalensis). Food Hydrocolloids, 43: 708—716