發(fā)光細(xì)菌法在環(huán)渤海污水樣品遺傳毒性檢測中的應(yīng)用*

崔志松　欒　曉　高　偉　李　倩　楊官品　鄭　立①

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院　青島　266003; 2. 國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心　青島　266061)

環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)圈為中國經(jīng)濟(jì)的第三個隆起地帶(李立華, 2004), 在對環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)開發(fā)的同時, 一些工業(yè)廢水、生活污水的排放造成環(huán)渤海的生態(tài)環(huán)境惡化,受污染的水質(zhì)嚴(yán)重威脅人類健康、漁業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)安全。人類向環(huán)渤海的海域中排放了大量具有遺傳毒性的“三致”(鄭相宇等, 2004)污染物, 危害人類的健康,對渤海水質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行快速、有效的監(jiān)測, 可為降低生態(tài)健康風(fēng)險提供技術(shù)支撐。傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法雖然數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠, 但是對于惡化的水質(zhì)中的有機(jī)混合物, 檢測過程費(fèi)力費(fèi)時而且昂貴, 對于一些突發(fā)意外事故, 例如蘭州飲用水苯超標(biāo)事件, 化學(xué)檢測法面臨著挑戰(zhàn)。生物傳感器在這方面是一個補(bǔ)充, 檢測方法操作簡便、成本低, 適于現(xiàn)場快速和高通量應(yīng)用, 且能反映樣品中毒性物質(zhì)間的拮抗、加合和協(xié)同作用(Sorensenet al, 2006)。

發(fā)光細(xì)菌法(luminescence bacteria test, LBT)常被用作早期預(yù)警系統(tǒng)。其中國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 15411-1995提出了用明亮發(fā)光桿菌 T3小種作為水質(zhì)急性毒性的檢測方法。還有重金屬污染土壤的檢測方法(李彬等,2001), 那廣水等(2010)采用發(fā)光細(xì)菌檢測排污口的總有機(jī)污染物的急性毒性等, 都是使用 T3作為供試菌種。ADPWH_ALK發(fā)光細(xì)菌被應(yīng)用于檢測大連溢油的生物毒性檢測(Zhanget al, 2013), 越來越多的發(fā)光細(xì)菌作為生物傳感器檢測水質(zhì)、土壤等受污染的狀況。

經(jīng)遺傳改造的不動桿菌RecA菌株(Acinetobactersp. RecA)的染色體上具有recA基因(毛裕民等, 1989)與發(fā)光基因luxCDABE基因(茆婷等, 2009)的融合結(jié)構(gòu)。luxCDABE基因最初由土壤微生物Photorhabdus luminescens中發(fā)現(xiàn)并分離得到(何文杰等, 2007),luxCDABE不含啟動子, 轉(zhuǎn)錄受其上游的 recA 基因控制,luxCDABE基因編碼熒光素酶, 在熒光素酶作用下, FMNH2和RCHO被O2氧化, 產(chǎn)生的能量并不被生物體儲存, 而是通過光的形式釋放出來。絲裂霉素C (Mitomycin C, 以下簡稱MMC)是一種常見的遺傳毒物。當(dāng)細(xì)胞暴露于遺傳毒物引起 DNA受損時,recA基因與 DNA損傷修復(fù)相關(guān)。雖然不動桿菌的recA基因的作用機(jī)制尚不清晰, 但有研究表明其具有與大腸桿菌中 recA基因類似的功能(Greggjollyet al, 1994; Hareet al, 2006), 因此recA基因的表達(dá)將引起luxCDABE基因大量表達(dá)熒光素酶, 通過儀器測量其光強(qiáng), 即實(shí)現(xiàn)生物傳感功能。

環(huán)渤海受污染的水質(zhì)中, 重金屬、石油烴等污染物含量不盡相同, 所具有的總遺傳毒性也不相同, 本文采用經(jīng)過遺傳改造的不動桿菌 RecA(宋一之等,2010)對環(huán)渤海的12個排污口污水樣品的遺傳毒性進(jìn)行快速檢測和評價, 為今后近海海洋環(huán)境的監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器設(shè)備單管式化學(xué)發(fā)光檢測儀(德國Berthold公司, Lumat LB9507), 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司, SW-CJ-1FD), 恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器公司, THZ-100 biuepard), 分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司, Unico WFJ2000),自動滅菌鍋(日本 Tomy SS-325), pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司, FE20), 鹽度計(jì)(EUTECH instruments)。

1.1.2供試菌種采用經(jīng)遺傳改造的不動桿菌RecA菌株(Acinetobactersp. RecA)作為發(fā)光細(xì)菌對環(huán)渤海污水樣品進(jìn)行生物毒性檢測。

1.1.3發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)基LB_K培養(yǎng)基, Tryptone(Oxoid LTD, Basingstoke, Hampsshire, England) 10g,Yeast (Oxoid LTD, Basingstoke, Hampsshire, England)5g, NaCl (滬試, AR) 10g, pH 7.0, 121°C滅菌后添加卡那霉素(北京方程, Sigma試劑)至終濃度10μg/mL。

1.1.4環(huán)渤海排污口樣品污水樣品采自環(huán)渤海排污口的12個站點(diǎn), 分別是受污染較為嚴(yán)重的河道、鋅廠、造紙廠等, 其地理位置見圖1。

圖1　采樣站位區(qū)域分布圖Fig.1　Distribution of the sampling sites in the Bohai Sea

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水樣的采集和前處理采用500mL棕色瓶采集污水樣品, 低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行生物毒性測試。采用純凈水作為現(xiàn)場空白樣。

1.2.2發(fā)光細(xì)菌的準(zhǔn)備采用接種環(huán)將甘油凍存的發(fā)光細(xì)菌RecA在LB_K平板上劃線, 經(jīng)培養(yǎng)后從平板上挑取RecA單菌落接種到50mL LB_K液體培養(yǎng)基中, 于恒溫?fù)u床中30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)16h,所得菌液保存于4°C, 此液為種子液。

取1mL種子液接種到50mL LB_K中, 于恒溫?fù)u床中 30°C、150r/min振蕩培養(yǎng) 16h, 測定 OD600值, 以確定達(dá)到平臺期。所得菌液及時使用, 此為檢測污染物生物毒性實(shí)驗(yàn)用的菌液。

1.2.3遺傳毒性測試體系采用無菌水作為遺傳毒性檢測過程中的陰性對照樣品。分別采用0.02、0.1、0.2、1、2mg/L的MMC作為遺傳毒性檢測過程中的陽性對照樣品。前期研究表明,RecA在稀釋100倍時, 對MMC的響應(yīng)最明顯。

RecA進(jìn)行遺傳毒性檢測的體系為: 10μL重懸菌液 + 990μL污水樣品(或陽性對照、陰性對照)。

所有檢測污水樣品及對照樣品均設(shè)置3個平行。

1.2.4鹽度對 RecA發(fā)光曲線的影響RecA發(fā)光細(xì)菌對鹽度敏感, 過大或者過小的鹽度對發(fā)光會造成明顯影響, 在污水樣品測試過程中, 不但需要維持陰性對照、陽性標(biāo)準(zhǔn)以及污水樣品的鹽度統(tǒng)一,還要選取適當(dāng)?shù)柠}度, 使得 RecA的發(fā)光變化表現(xiàn)最明顯。

鹽度的調(diào)整使用NaCl, 每個陰性、陽性對照以及樣品的鹽度均調(diào)整為35。

1.2.5污水樣品遺傳毒性的檢測根據(jù)污水樣品對菌株RecA在3h后的發(fā)光誘導(dǎo)率。

平均相對發(fā)光率(LR) = 樣品或陽性對照平均相對發(fā)光量(RLU) / 空白對照平均相對發(fā)光量(RLU)

相對發(fā)光誘導(dǎo)率(IR) = LR－1

得到回歸線性方程, 并查相關(guān)系數(shù)顯著水平P值表, 檢驗(yàn)所求r值的顯著水平P＜0.01, 所求的方程成立, 反之不成立。根據(jù)回歸方程計(jì)算污水樣品中有毒污染物等效應(yīng)的MMC濃度, 并根據(jù)其等效應(yīng)濃度值確定遺傳水平的大小。毒性分級情況詳見表1。

表1　水質(zhì)遺傳毒性的分級Tab.1　The genotoxicity classification of water quality

2　結(jié)果與討論

2.1　鹽度確定實(shí)驗(yàn)

2.1.1鹽度對RecA發(fā)光強(qiáng)度的影響RecA對于測試環(huán)境中的鹽度有比較大的反應(yīng), 每個樣品的鹽度不一樣, 勢必會造成發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光產(chǎn)生變化,應(yīng)維持陽性對照以及樣品中鹽度的統(tǒng)一。如圖2所示, 鹽度越低, RecA隨時間的發(fā)光值就會變得越大,50、70的鹽度對RecA發(fā)光的影響雖然近似平穩(wěn), 但是數(shù)值太低, 實(shí)驗(yàn)中會出現(xiàn)較大的誤差, 0、5、10鹽度數(shù)值升高的幅度很大, 但是發(fā)光并不穩(wěn)定, 發(fā)光快速升高的情況有可能抵消RecA被污染物質(zhì)影響發(fā)光下降的情況。因此在遺傳毒性檢測的時候, 選取 30附近的鹽度, 發(fā)光趨于平穩(wěn), 并且數(shù)值較大, 可以反映遺傳毒性的大小。

圖2　不同鹽度下RecA發(fā)光細(xì)菌隨時間的發(fā)光變化Fig.2　Luminescence changes in RecA luminous bacteria in different salinities over time

2.1.2污水樣品的鹽度測定結(jié)果使用鹽度計(jì)測試污水樣品的鹽度, 發(fā)現(xiàn)大部分站點(diǎn)的鹽度偏低, 如表2所示, 僅有 BH5和 BH10兩個站點(diǎn)的鹽度接近10, 沒有達(dá)到發(fā)光細(xì)菌表現(xiàn)的最適鹽度, 所以需要通過添加NaCl將污水樣品組的鹽度調(diào)整到35, 陽性對照組的鹽度也是 35, 從而實(shí)現(xiàn)相同鹽度條件下發(fā)光細(xì)菌對陽性對照以及對樣品的測定。

表2　12個排污口的測定鹽度和調(diào)整后的鹽度Tab.2　The salinity measured and adjusted for all 12 outfalls

2.2　遺傳毒性評價

圖3　不同濃度下MMC的誘導(dǎo)率IRFig.3　The IR at different concentrations of MMC

2.2.1MMC的陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線不同濃度MMC的IR如圖3所示。隨著MMC濃度的增加,RecA的發(fā)光增強(qiáng)呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系, 在 3h時, 通過公式計(jì)算發(fā)光誘導(dǎo)率。y= 97.67x+ 17.052,R2= 0.9755,實(shí)驗(yàn)所求的r值的顯著水平P=0.0016＜0.01, 所求的方程成立。可以采用此方程計(jì)算樣品對發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的發(fā)光誘導(dǎo)率, 并對遺傳毒性進(jìn)行評價。

2.2.2實(shí)驗(yàn)樣品對 RecA 的發(fā)光影響樣品中, 根據(jù)污染物化學(xué)檢測結(jié)果, 每個站點(diǎn)具有遺傳毒性的重金屬、VOCs、石油烴以及PAHs含量各不相同。對于發(fā)光細(xì)菌的影響也不相同, 根據(jù)1.2.5中的相對發(fā)光誘導(dǎo)率的公式, 計(jì)算陽性對照以及樣品的相對發(fā)光誘導(dǎo)率, 具體的相對發(fā)光誘導(dǎo)率大小如圖4所示。

圖4　陽性對照以及每個排污口站點(diǎn)的誘導(dǎo)率Fig.4　The IR of the positive control and every outfall site

實(shí)驗(yàn)中, BH1、BH2、BH3、BH4對于RecA的誘導(dǎo)作用十分明顯, 表現(xiàn)出明顯的遺傳毒性, 有的站點(diǎn)例如BH5、BH6、BH7、BH8對RecA的誘導(dǎo)作用不明顯, 相應(yīng)的遺傳毒性也不明顯, 剩余的一部分BH9、BH10、BH11、BH12對RecA的誘導(dǎo)屬于中等,表現(xiàn)出的遺傳毒性也是中等。

2.2.3遺傳毒性分析等效應(yīng)的 MMC濃度計(jì)算,根據(jù) 2.2.1的相對發(fā)光誘導(dǎo)率的公式, 根據(jù)相對發(fā)光誘導(dǎo)率的大小計(jì)算所對應(yīng)的x值即等效應(yīng)的MMC濃度, 如表3所示。

表3　每個排污口的相對發(fā)光誘導(dǎo)率、等效應(yīng)MMC濃度以及毒性分級Tab.3　The IR, equivalent MMC concentration, and toxicity evaluation at each outfall

從毒性分級的對比情況看, 每個站點(diǎn)的遺傳毒性具有顯著差異, 并且低毒、中毒、高毒、劇毒都有表現(xiàn), 如圖5所示, 排污口中的水受到不同污染物(例如重金屬、VOCs、PAHs和石油烴)的污染, 其遺傳毒性的總和在RecA發(fā)光細(xì)菌中得到了表現(xiàn), 一些大理石切割廠、造紙廠、化工廠以及鋅廠排放的污水中,遺傳毒性屬于高毒和劇毒, 此處站點(diǎn)水樣顏色發(fā)紅發(fā)黑, 水質(zhì)大多惡臭, 很難有生物生存。

圖5　不同毒性分級所占比例Fig.5　The proportion of different toxicity grades

從取水樣的地理位置看, 山東半島臨近環(huán)渤海地區(qū)取樣4個站點(diǎn)中, 毒性屬于高毒以上, BH4站點(diǎn)的遺傳毒性甚至居于劇毒, 此處站點(diǎn)化工廠較多, 排放的污染物質(zhì)也居多。遼東半島的4個站點(diǎn)毒性總體比山東半島低一些, 但也屬于高毒區(qū)域, 造成此站點(diǎn)遺傳毒性居高的原因中, 一些鋅廠、造紙廠排放的污水起到了很大作用。毒性最小的4個站點(diǎn)屬于京津冀地區(qū), 此地區(qū)的站點(diǎn)排污口臨近于河水, 以生活類污水為主, 總的遺傳毒性明顯低于山東半島和遼東半島的排污口。

3　結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)是使用遺傳改造的不動桿菌對環(huán)渤海的排污口水質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行的檢測, 此發(fā)光細(xì)菌可以直接反應(yīng)總遺傳毒物的含量, 確定水質(zhì)對生物體的遺傳影響, 在一定范圍內(nèi), 遺傳毒物劑量越大、毒性越強(qiáng), 菌株的發(fā)光強(qiáng)度越高。通過儀器測量其光強(qiáng), 證明了RecA菌株作為一種生物傳感器可快速檢測環(huán)渤海排污口中受污染的水質(zhì), 實(shí)現(xiàn)遺傳毒性的檢測與評價。RecA喪失染色體進(jìn)一步同源重組的能力, 具有較高的遺傳穩(wěn)定性, 在環(huán)境樣品遺傳毒性的高靈敏度迅速檢測中具有廣闊的前景。而對于單獨(dú)檢測水體中重金屬、石油烴、PAHs甚至是富營養(yǎng)化物質(zhì)來確定水質(zhì)毒性, 發(fā)光細(xì)菌具有更加直觀簡便的特點(diǎn)。

隨著檢測體系的完善, 發(fā)光細(xì)菌法將和電子技術(shù)以及光電技術(shù)相結(jié)合(王兆群等, 2009), 逐步發(fā)展為在線監(jiān)測系統(tǒng), 為水質(zhì)分析提供更加快速的測試手段。另一發(fā)展方向就是與先進(jìn)的化學(xué)分析方法(方戰(zhàn)強(qiáng)等, 2003)相結(jié)合, 為環(huán)境監(jiān)測提供更加全面和細(xì)微的毒性分析。

王兆群, 司皖甦, 嚴(yán)剛, 2009. 發(fā)光細(xì)菌法在環(huán)境檢測中的應(yīng)用. 環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警, 1(2): 14—17

毛裕民, 程海平, 盧建徽等, 1989. 大腸桿菌中整合的 F’質(zhì)粒帶動細(xì)菌染色體復(fù)制需要recA基因. 遺傳學(xué)報, 16(1):56—66

方戰(zhàn)強(qiáng), 陳中豪, 胡勇有等, 2003. 發(fā)光細(xì)菌法在水質(zhì)檢測中的應(yīng)用. 重慶環(huán)境科學(xué), 25(2): 56—58

那廣水, 張?jiān)旅? 陳彤等, 2010. 發(fā)光細(xì)菌法評價排污口污水中總有機(jī)污染物的毒性. 中國環(huán)境監(jiān)測, 26(5): 61—64

李彬, 李培軍, 王晶等, 2001. 重金屬污染土壤毒性的發(fā)光菌法診斷. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 12(3): 443—446

李立華, 2004. 環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)圈發(fā)展戰(zhàn)略研究. 宏觀經(jīng)濟(jì)研究,12: 38—42

何文杰, 顧金輝, 康華等, 2007. 混凝-超濾工藝處理灤河水的中試研究. 中國給水排水, 23(9): 73—76

宋一之, 黃巍, 張旭等, 2010. 遺傳毒性檢測生物傳感細(xì)胞的靈敏度及穩(wěn)定性研究. 清華大學(xué)學(xué)報, 50(11): 1880—1884, 1889

茆婷, 何偉, 鐘文輝等, 2009. 報告基因技術(shù)及其在土壤質(zhì)量檢測中的應(yīng)用. 生態(tài)學(xué)報, 29(12): 6733—6740

鄭相宇, 張?zhí)? 劉志強(qiáng)等, 2004. 水體污染物“三致”效應(yīng)的生物監(jiān)測研究進(jìn)展. 生態(tài)學(xué)雜志, 23(4): 140—145

Greggjolly A, Omston N, 1994. Properties ofAcinetobacter calcoaceticusrecA and its contribution to intracellular gene conversion. Molecular Microbiology, 12(6): 985— 992

Hare M, Perkins N, Greggjolly A, 2006. A constitutively expressed, truncated umuDC operon regulates the recA-dependent DNA damage induction of a gene inAcinetobacter baylyistrain ADP1. Applied and Environmental Microbiology, 72(6): 4036—4043

Sorensen S J, Burmolle M, Hansen L H, 2006. Making biosense of toxicity: New developments in whole-cell biosensors.Current Opinion in Biotechnology, 17(1): 11—16

Zhang Dayi, Ding Aizhong, Cui Shuangchaoet al, 2013. Whole cell bioreporter application for rapid detection and evaluation of crude oil spill in seawater caused by Dalian oil tank explosion. Water Research, 47: 1191—1200