柴苓湯對環孢素A腎病大鼠MCP-1、TNF-a的調控作用*

黃晉紅，潘秋霞，張城浩，王香婷，3，王聰慧，魏 民

(1.武警河北總隊醫院，石家莊 050081;2.河北醫科大學，石家莊 050017; 3.河北中醫學院，石家莊 050200)

柴苓湯對環孢素A腎病大鼠MCP-1、TNF-a的調控作用*

黃晉紅1，潘秋霞2，張城浩2，王香婷2，3，王聰慧2，魏 民3△

(1.武警河北總隊醫院，石家莊 050081;2.河北醫科大學，石家莊 050017; 3.河北中醫學院，石家莊 050200)

目的:觀察柴苓湯對慢性環孢素A腎病大鼠單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及腫瘤壞死因子-a(tumour necrosis factor-a，TNF-a)的影響，探討炎癥反應在環孢素A腎病中的作用及柴苓湯的調控機制。方法:采用經口灌服環孢素A［30 mg/(kg·d)］的方法復制慢性環孢素A腎病大鼠模型，同時給予柴苓湯［3 g/(kg·d)］及纈沙坦［10 mg/(kg·d)］治療共28 d，摘取腎臟觀察腎臟病理變化。RT-PCR、免疫組化方法檢測大鼠腎臟MCP-1、TNF-a蛋白及mRNA的表達。結果:病理顯示模型組大鼠腎臟大量炎性細胞浸潤，腎小管間質膠原成分明顯增多，與對照組比較，MCP-I、TNF-a蛋白及mRNA表達顯著增強。經柴苓湯及纈沙坦治療，大鼠腎臟炎性細胞浸潤及膠原沉積均減輕，MCP-I及TNF-a高表達被顯著下調。結論:柴苓湯可減輕炎癥損傷，減少ECM沉積，從而延緩慢性CsA腎病纖維化進程。

柴苓湯;環孢素A腎病;MCP-1;TNF-a

環孢素 A(cyclosporine A，CsA)是一種強有效的免疫抑制劑，主要用于器官移植及自身免疫性疾病的治療。自20年前應用于器官移植以對抗排斥反應以來，大大提高了移植器官及病人的生存率，但腎毒性限制了其臨床應用。臨床數據顯示，應用CsA 10年以上的患者基本都表現出不同程度的慢性腎臟損傷［1］。CsA腎病(chronic cyclosporine A nephropathy，CCN)的發病機制極其復雜，與腎素-血管緊張素系統(RAS)、一氧化氮(NO)、氧化應激、上皮細胞表型轉化等因素有關。我們的前期研究顯示，柴苓湯可以改善CsA腎病大鼠腎功能，抑制腎小管上皮細胞表型轉化，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，具有腎臟保護作用［2-4］。研究同時發現，動物模型中，炎性細胞浸潤和炎性介質表達明顯，考慮炎癥反應在CCN中起重要作用。本研究采用CsA慢性腎病模型，通過觀察柴苓湯對炎性介質TNF-a及趨化因子MCP-1的影響，探討炎癥反應在CCN中的作用及柴苓湯的調控機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

40只8周齡雌性清潔級SD大鼠，體質量(200±10)g，河北醫科大學動物實驗中心提供(動物合格證號SCXK(冀)2013-1-003)。按隨機數字表法分為對照組、模型組、纈沙坦組、柴苓湯組各10只。

1.2 藥物及試劑

柴苓湯顆粒型3 g/袋，由柴胡、黃芩、半夏、人參、甘草、生姜、大棗、豬苓、桂枝、白術、茯苓、澤瀉組成，購自日本 TSMURA株式會社(No:114)。環孢素軟膠囊由華北制藥股份有限責任公司提供(批號FJC1401002)，用橄欖油將其配制成質量濃度為15 mg/mL的溶液備用。纈沙坦由桂林華信制藥有限公司提供(批號140209)。RT-PCR主要試劑:DEPC (Sigma，E174);RNAiso Plus(TaKaRa，Code No:9108)，RT Reagents(TaKaRa，Code No:62120A)，PCR Reagents (TaKaRa，Code No:R004A)，DNA Marker(TaKaRa，Code No:3427A)。MCP-1(Santa Cruz Biotechnology，sc-1785)，TNF-a(Santa Cruz Biotechnology，sc-1350)，免疫組化試劑盒(VECTASTAIN ABC KIT，PK-4005)。

1.3 主要儀器

LEICA RM2245石蠟切片機(萊卡上海分公司)、高速冷凍離心機1-15K(美國 Sigma公司)、OLYMPUS全能顯微鏡BX-UCB(日本OLYMPUS公司)、凝膠圖像分析系統(Scion Image 4.0.3.2圖像分析系統)、756MC型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)、PE9600型PCR擴增儀(美國PE公司)、電泳儀及電泳槽(北京六一)、紫外透射儀(北京鼎國)、超低溫保存箱(MDF-382E，日本SANYO)。

1.4 造模及給藥

40只大鼠適應性飼養 1周后，參考相關文獻［5］，模型組、纈沙坦組及柴苓湯組給予 CsA 30 mg/(kg·d)溶解于橄欖油經口灌服，復制環孢素A腎病大鼠模型，對照組經口灌服等容量橄欖油;造模同時纈沙坦組給予纈沙坦10 mg/(kg·d)，柴苓湯組給予柴苓湯3 g/(kg·d)(相當于成人劑量20倍)，灌胃給藥，對照組和模型組每日給予等容量生理鹽水共28 d。實驗動物于第29天斷頭處死，切取腎臟，4%多聚甲醛固定用于免疫組化，部分腎組織-70℃保存用于提取RNA及蛋白。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 組織學檢查 3 um的石蠟切片，行HE、Masson染色，光學顯微鏡下觀察病理改變。

1.5.2 免疫組化檢測MCP-I、TNF-a蛋白表達

采用 ABC法，切片厚3 μm，脫蠟;PBS浸洗 5 min，用濾紙將組織周圍的水分吸干;3%過氧化氫，室溫下孵育20 min;PBS清洗3次，每次5 min;枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波爐內修復，98℃維持 10 min;冷卻至室溫;PBS清洗3次，每次5 min;滴加非免疫性血清封閉，室溫孵育30 min;加入一抗4℃過夜，PBS清洗3次，每次5 min;滴加生物素標記的二抗，室溫60 min，PBS清洗3次，每次5 min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，37℃孵育 30 min，PBS清洗3次，每次5 min;DAB顯色1 min，光鏡下控制細胞顯色程度5～20 min;自來水充分沖洗，終止顯色;蘇木素復染細胞核;常規酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以鏡下出現棕黃色顆粒為陽性表達，以PBS替代二抗作為陰性對照。

1.5.3 RT-PCR檢測MCP-I、TNF-a mRNA表達 100 mg腎臟組織按試劑盒說明提取RNA，用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260和280 nm及320 nm處讀取OD值，OD260/OD280=1.7-2.1間方可使用，總RNA濃度=(OD260-OD320)×稀釋倍數×0.04(ug/ul)。用前調整為1 ug/ul，取2ul總RNA用反轉錄試劑反轉成cDNA。TNF-alpha上游引物:5'-TAC ACT GGC CCG AGG CAA CA-3'，下游引物:5'-GGG CAA GGG CTC TTG ATG GC-3'，擴增片段為582bp;MCP-1上游引物:5'-ACA GAC AGA GGC CAG CCC AG-3'，下游引物:5'-TCT CCA GCC GAC TCA TTG GGA-3'，擴增片段為215bp;18S上游引物:5'-CAC GGT GTC ACC CAG ACC CG-3'，下游引物:5'-AGC AGA GGC AGT GGC AGA CT-3'，擴增片段為273bp。取cDNA 2 μL，加入引物2 μL、緩沖液5 μL，dNTP 5 μL、taq酶1/8 μL，加雙蒸水至50 μL。擴增條件:變性:94℃30 s;退火:55℃ 30 s;延伸:72℃ 30 s，循環30次。使用Gene Amp PCR系統9700(USA)擴增。最后取20 μL擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，于紫外燈下拍照，將膠片上的反應條帶在Scion Image 4.0.3.2圖像分析系統中分析。18S相對含量用相同PCR反應中光帶的強度來衡量mRNA在基因應答中的表達，實驗重復3次。產物電泳后，紫外燈下拍照，用凝膠圖像分析系統進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度比值表示。

1.6 統計學方法 使用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，數據資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 腎組織病理形態學觀察

HE染色結果顯示，對照組大鼠腎臟結構未見異常，腎小管上皮細胞排列整齊，間質無水腫，偶見炎性細胞浸潤。模型組腎小管上皮細胞變性、濁腫、脫落，腎間質可見大量炎性細胞浸潤。2治療組腎間質有輕度炎性細胞浸潤。Masson染色結果顯示，對照組結構清晰，腎小球/腎小管基底膜及腎間質可見少量膠原成分。模型組腎小管間質膠原成分顯著增多，主要表現在腎間質。纈沙坦組及柴苓湯組腎間質膠原成分較模型組明顯減少(圖1、2)。

2.2 各組大鼠免疫組化檢測結果比較

圖3、4顯示，對照組大鼠腎組織MCP-I及TNF-a呈弱陽性，模型組大鼠MCP-I及TNF-α蛋白水平較對照組明顯增強(P＜0.05)，呈深黃或黃褐色，主要表達于腎小管上皮細胞內。經治療，纈紗坦組、柴苓湯組大鼠MCP-I及TNF-a蛋白表達顯著減少(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠腎臟炎性細胞浸潤情況

圖2 各組大鼠腎臟間質膠原沉積情況

圖3 免疫組化染色示各組大鼠腎臟MCP-1蛋白表達

2.3 各組大鼠RT-PCR檢測結果比較

圖5表1顯示，與對照組比較，模型組大鼠MCP-1及TNF-a mRNA表達明顯增強(P＜0.05)。2用藥組大鼠MCP-1、TNF-a mRNA表達較模型組明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

炎性損傷是慢性疾病持續進展中的關鍵因素，抗炎治療成為新的靶點［6］。炎癥反應在CsA腎病早期即出現并持續存在于疾病全過程［7］。許多數據顯示，炎性損傷先于纖維化出現，是慢性腎臟疾病包括CCN病起病及發展的主要因素［8］。

圖4 免疫組化染色示各組大鼠腎臟TNF-a蛋白表達

圖5 各組大鼠腎臟MCP-1及TNF-a mRNA表達

表2 各組大鼠腎臟MCP-1及TNF-a mRNA表達比較(±s)

表2 各組大鼠腎臟MCP-1及TNF-a mRNA表達比較(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05;與模型組比較:■P＜0.05

組別MCP-1 mRNA TNF-a mRNA對 照 組95.33±6.11 141.00±18.68模 型 組 159.00± 8.54* 219.33±11.02*纈 沙 坦 組 140.67±14.74＊■ 183.00±10.54＊■柴 苓 湯 組 128.00± 5.57＊■ 174.00± 5.29＊■

應用CsA后腎臟內毛細血管收縮，微循環障礙，使腎組織缺血、缺氧繼而激活腎臟固有細胞產生，分泌炎性細胞和炎性介質，如TNF-a、IL-1及趨化因子MCP-1等，炎癥趨化因子促使大量單核細胞和巨噬細胞在腎小球、腎小管間質聚集，浸潤的炎性細胞一方面產生大量致纖維化因子，直接參與腎纖維化［9］;另一方面又分泌炎性介質，形成瀑布反應，使炎性細胞浸潤和慢性炎癥持續存在。持續存在的炎癥反應導致成纖維細胞分泌大量膠原進行損傷修復，膠原的生成增加而降解減少，大量膠原成分異常沉積于細胞外，造成腎纖維化。

TNF-a是公認的直接炎性因子，參與多種生理和免疫過程，刺激系膜細胞表達黏附分子、血管活性肽等細胞因子，并刺激成纖維細胞增生，促進膠原纖維的沉積［10］。MCP-1屬于趨化因子CC亞家族，主要功能是趨化和激活單核細胞至炎癥部位，還可活化并促進血管平滑肌細胞、腎小管上皮細胞等固有細胞產生炎癥因子，進一步放大間質的炎癥反應。

本實驗組織病理學顯示，應用CsA后小管間質大量炎性細胞浸潤，膠原沉積較多，蛋白及基因檢測表明，模型組大鼠腎臟組織MCP-1及TNF-a的表達均明顯增強，說明炎性反應參與了慢性環孢素A腎病進程，介導了纖維化的發生。

CCN屬于中醫學“水腫”、“腰痛”、“癃閉”、“淋證”、“關格”等疾病范疇。CsA作為免疫抑制劑在器官移植術后發揮積極治療作用的同時，作為“藥毒”壅積于腎，成為新的致病因素。“大毒治病，十去其六，無使過之，傷其正也”(《素問·五常政大論》)。藥毒傷腎，腎氣虧虛，蒸騰氣化功能失職，不能泄濁排毒，濕濁溺毒蓄積體內，釀為濁毒。日久損傷腎腑，形成“微小癥瘕”瘀阻腎絡，終致真元虛損，陰陽失調，開合失司，臟腑衰敗。我們認為這是由外毒(環孢素A)傷腎產生的內毒(濁毒)，據此確立瀉濁解毒的基本治則，解毒以祛除損害因素，瀉濁以排出內生之毒。

根據治則我們選擇具有瀉濁解毒、通利三焦功效的柴苓湯作為治療藥方。柴苓湯由《傷寒雜病論》中的“小柴胡湯”和“五苓散”組合而成，可利小便，使內生濁毒有出路;疏利三焦使排毒管道通暢，氣機條達。目前柴苓湯主要用于治療水液代謝障礙性疾病、自身免疫性疾病，可增效減毒、改善生活質量。臨床上柴苓湯用于治療多種腎病并取得了較好療效［11-13］。本研究組針對應用CsA的病人采用柴苓湯防治，可明顯減輕癥狀，降低蛋白尿，保護腎功能。柴苓湯的主要有效成分是柴胡皂甙-d，可以抑制炎癥反應和纖維化因子，起到腎臟保護作用［14-15］。實驗表明，柴苓湯可下調 a-SMA的高表達，通過抑制腎小管上皮細胞的表型轉化，減緩腎間質纖維化的進程［2］，并通過誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，恢復細胞凋亡與增殖平衡而發揮腎臟保護作用［3-4］。

本實驗結果顯示，柴苓湯干預后，炎性細胞浸潤及炎性介質表達明顯減輕，膠原沉積較少，說明柴苓湯可通過抑制炎癥反應延緩CCN纖維化進程，而炎癥反應介導纖維化發生的途徑還需要進一步探討。

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Regulation Effect of Chailing Decoction on MCP-1，TNF-a of the Cyclosporine A Aephropathy Rats

HUANG Jin-hong1，PAN Qiu-xia2，ZHANG Cheng-hao2，WANG Xiang-ting2，3，WANG Cong-hui2，WEI Min3△
(1.Hebei Provincial Corps Hospital，Chinese People’s Armed Police Forces，Shijiazhuang 050081，China;2.Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;3.Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China)

Objective:To observe the effect of Chailing Decoction(CLD)on monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)and tumour necrosis factor-α(TNF-α)in rats with chronic cyclosporine A nephropathy(CCN)for investigating the function of inflammation and regulatory mechanism of CLD.Methods:The CCN rat models were prepared using oral administration of cyclosporine A(30 mg·kg-1·d-1).Meanwhile，they were treated with CLD(3 g·kg-1·d-1)and valsartan(10m g·kg-1·d-1)by gastrogavage for 28 days respectively.The kidneys were harvested on the 29th day and observed the pathology changes.The protein and gene expressions of MCP-I and TNF-a were observed using RT-PCR and immunohistochemical assay.Results:Renal pathology showed the inflammatory cell infiltration and collagen deposition in the renal interstitial area of CsA group was significantly increased.Compared with the control group，the protein and mRNA expressions of MCP-I and TNF-a of CsA group were significantly enhanced，and the high levels were down-regulated after treatment.Conclusions:CLD could retard the progress of CCN renal interstitial fibrosis by alleviating inflammation and reducing the deposition of ECM.

Chailing decoction;Cyclosporine A nephropathy;MCP-1;TNF-α

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0812-04

2015-02-18

河北省自然科學基金資助項目(H2014206284)

黃晉紅(1964-)，女，主任醫師，醫學學士，從事中醫病證基礎研究。

△通訊作者:魏 民(1969-)，男，副教授，醫學碩士，從事腎臟病的基礎研究，Tel:0311-89926793，E-mail:wm5375@163.com。