針刺對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度、骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響*

王亞軍，劉梅潔，鞠大宏，劉 靜，徐亞莉，劉丁龍，高 原

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，蘭州 730000;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100070)

針刺對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度、骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響*

王亞軍1，2，劉梅潔2，鞠大宏2，劉 靜1，徐亞莉1，劉丁龍1，高 原1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，蘭州 730000;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100070)

目的:觀察針刺對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度、骨計(jì)量的影響。方法:雌性SD大鼠50只按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組、假手術(shù)組(sham)、模型組(OVX)、己烯雌酚組、電針組各10只。行雙側(cè)卵巢切除術(shù)復(fù)制骨質(zhì)疏松模型，造模飼養(yǎng)13周后開始治療。分別給予己烯雌酚灌胃，針刺穴取“三陰交”、“足三里”、“腎俞”、“脾俞”，連接電針每次15 min，所有治療均連續(xù)5 d，休息2 d，共治療13周。治療結(jié)束后，測量全身骨密度(BMD)，處死大鼠取左側(cè)脛骨近端1/3，制作不脫鈣骨切片，觀察骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、類骨質(zhì)平均寬度(OSW)、骨小梁礦化率(MAR)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BMD顯著降低，脛骨TBV%顯著降低，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均顯著升高;與模型組比較電針組大鼠BMD明顯增高，脛骨TBV%明顯增高，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均明顯降低。結(jié)論:針刺可以提高去卵巢后大鼠的骨密度和大鼠脛骨TVB%，同時(shí)降低大鼠脛骨TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR，提示針刺治療骨質(zhì)疏松主要是通過對(duì)骨吸收的影響發(fā)揮作用。

骨質(zhì)疏松癥;針刺;骨密度;骨計(jì)量

隨著人均壽命的不斷延長，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢，估計(jì)到2050年由于骨質(zhì)疏松癥而導(dǎo)致的骨折將會(huì)增加到6.3億［1］。婦女由于生理原因，大約1/5的絕經(jīng)后婦女將會(huì)罹患與骨質(zhì)疏松有關(guān)的骨折［2］，尤其是脊柱和髖骨骨折往往伴隨很高的并發(fā)癥和死亡率［3］。骨質(zhì)疏松癥的治療，目前國內(nèi)外主要應(yīng)用藥物療法，但其臨床療效卻是有限的，且這些藥物存在著副作用大、長期耐受性差、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。雖然國內(nèi)應(yīng)用針刺治療骨質(zhì)疏松癥在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定進(jìn)展，但其療效評(píng)價(jià)、治療機(jī)制仍存在許多未解決的問題［4-5］。本實(shí)驗(yàn)觀察針刺對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度、骨計(jì)量的影響，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

SPF級(jí)雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證編號(hào)SCXK(甘)2011-0001)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組(sham)、模型組(OVX)、己烯雌酚組、電針組各10只。

1.2 主要試劑和儀器

己烯雌酚:合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20100108)，給藥劑量0.045 mg/kg體質(zhì)量;水合氯醛:天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所(批號(hào)20130305);鹽酸四環(huán)素:美國 Amresco公司生產(chǎn)(批號(hào)20120301);冷凍切片機(jī):英國TBS公司;Prodigy-BX IL型骨密度儀測量儀 (雙能X線):美國 Lunar公司;針灸針:蘇州針灸器械廠，1寸 0.35×13 mm; G6805-Ⅱ型電針:鑫升有限責(zé)任公司;Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 適用性飼養(yǎng)1周，參照文獻(xiàn)方法［6］行雙側(cè)摘除卵巢形成骨質(zhì)疏松模型:將大鼠以10%水合氯醛(3 ml/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，腹位固定。在其最末肋骨下，腋中線與距脊柱外側(cè)約1 cm之交叉處剪去鼠毛。以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，外部敷以消炎粉，同法摘除另一側(cè)卵巢。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢但不切除。

1.3.2 治療 造模飼養(yǎng)13周后，開始治療。電針治療組穴取“三陰交”、“腎俞”、“脾俞”、“足三里“，定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［7］類比取穴。針具及穴位常規(guī)消毒后，用30號(hào)0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下相應(yīng)深度后，分別接G6805-Ⅱ型電針儀，波形疏密波頻率10 Hz，以大鼠肢體抽動(dòng)為度，雙側(cè)電針15 min。每周連續(xù)治療5次，休息2次，每次15 min，共治療13周。

己烯雌酚治療組根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算給藥劑量［8］，灌胃給予藥液濃度為0.0045 mg/ml的己烯雌酚，按照體質(zhì)量1 ml/100 g計(jì)算。連續(xù)5 d，休息2 d，治療13周。模型組(OVX)、假手術(shù)組(sham)除抓取刺激外，不給予任何處理。

1.3.3 檢測指標(biāo) 治療結(jié)束后，分別做以下測量:①骨密度:于最后1次針刺后，用10%水合氯醛(3ml/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠作腹腔注射麻醉，俯臥位置，采用 Prodigy-BX IL型骨密度測量儀 (美國LUNAR)，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中小動(dòng)物軟件測定大鼠全身骨密度，由計(jì)算機(jī)控制程序自動(dòng)分析并顯示結(jié)果;②骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測量:處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30 mg/kg體質(zhì)量，以對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。將各組大鼠處死，取左側(cè)脛骨近端1/3去除軟組織，參照文獻(xiàn)方法［9-10］制作不脫鈣骨切片，進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的檢測。采用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)對(duì)TBV%、TRS%、TFS%、OSW、MAR、Mar進(jìn)行計(jì)量分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，正態(tài)分布且方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用其項(xiàng)下的Dunnett’s T3檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨密度的影響

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BMD顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠BMD顯著增高(P＜0.01)，電針組大鼠BMD明顯增高(P＜0.05);電針組、己烯雌酚組BMD仍顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.01)，提示電針干預(yù)13周后可以使大鼠BMD升高，但未恢復(fù)到正常水平。

表1 各組大鼠骨密度變化比較

2.2 針刺對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響

2.2.1 針刺對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠脛骨TBV%的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨TBV%顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，電針組大鼠脛骨TBV%明顯增高(P＜0.05);己烯雌酚組大鼠脛骨TBV%顯著增高(P＜0.01);己烯雌酚組、電針組大鼠脛骨TBV%仍顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.01)，提示針刺干預(yù)后13周后大鼠脛骨TBV%未恢復(fù)到正常水平。

表2 各組大鼠脛骨TBV%變化比較

2.2.2 針刺對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠脛骨TRS%和TFS%的影響 表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組TRS%、TFS%顯著升高(P＜0.01，P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨TRS%、TFS%顯著降低(P＜0.01，P＜0.01);電針組大鼠脛骨TRS%、TFS%明顯降低(P＜0.05，P＜0.05)。與假手術(shù)組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨的TRS%、TFS%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01)，電針組大鼠脛骨的TRS%、TFS%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.05)，表明己烯雌酚、針刺治療13周后大鼠脛骨TRS%、TFS%恢復(fù)都未達(dá)到正常水平。

表3 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%的變化

2.2.3 針刺對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠脛骨OSW、MAR和MAR的影響 表4顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均顯著升高(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01);電針組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均明顯降低(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05);與假手術(shù)組比較，電針組脛骨的MAR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明MAR的恢復(fù)尚未達(dá)到正常水平。

表4 各組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的變化

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的骨骼疾病，多伴隨骨骼強(qiáng)度下降，骨折的高風(fēng)險(xiǎn)往往引起一系列嚴(yán)重臨床后果。中醫(yī)文獻(xiàn)尚無OP病名，但從其發(fā)病部位及臨床癥狀來看，屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“骨痿”范疇。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥乃本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)相兼之癥，肝脾腎痿虛、骨枯髓痿為本、邪阻經(jīng)絡(luò)為標(biāo);在此基礎(chǔ)上形成血瘀，痹阻經(jīng)絡(luò)又進(jìn)一步促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展［11］。因此治療應(yīng)首先改善腎虛同時(shí)兼顧脾肝，輔以通絡(luò)為要義。

針刺治療骨質(zhì)疏松癥常選取足太陽膀胱經(jīng)、督脈、足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、任脈等經(jīng)穴［12］。有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥所取經(jīng)穴的頻率發(fā)現(xiàn)，所選穴位以腎經(jīng)、脾經(jīng)穴位為多，其中以腎俞、脾俞、足三里三穴使用頻率為最高［13］。結(jié)合臨床研究工作我們制定了針刺處方，取三陰交、腎俞、足三里、脾俞組成針刺治療配穴方案。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模6個(gè)月后模型組(OVX)全身骨密度與假手術(shù)組比較顯著下降，這表明摘除卵巢復(fù)制骨質(zhì)疏松病理模型是成功的。經(jīng)過13周的干預(yù)，結(jié)果顯示己烯雌酚組、針刺組比模型組(OVX)大鼠骨密度明顯增高。其中服用己烯雌酚組效果最佳，說明該模型的確造成了雌激素下降，故對(duì)應(yīng)用己烯雌酚治療反應(yīng)性最好，表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托纬晒琴|(zhì)疏松模型是由于雌激素的下降導(dǎo)致的。從結(jié)果可以看出，針刺組骨密度明顯升高，這表明給予針刺治療對(duì)改善機(jī)體骨質(zhì)疏松的骨骼密度丟失有著積極意義。本研究從實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證了針刺對(duì)BMD的療效。

結(jié)合其他［14-18］采用同樣雙側(cè)去卵巢模型的相關(guān)研究，多觀察的是針刺干預(yù)8周、12周后BMD的變化，都顯示針刺可以改善去卵巢導(dǎo)致的BMD下降，其結(jié)論與我們的研究結(jié)論一致。但這些研究大多數(shù)采用的測量部位是脛骨股骨或腰椎的骨密度，很少采用全身骨密度作為骨密度變化的效應(yīng)指標(biāo)，全身骨密度是綜合全身肢體的骨骼總體密度平均值，因此應(yīng)用該指標(biāo)反應(yīng)骨質(zhì)變化更為全面。

與骨密度比較，骨組織形態(tài)學(xué)更具特異性，骨礦物與骨組織形態(tài)學(xué)測量有效結(jié)合可全面反映骨生理、病理與功能變化，從而對(duì)骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度作出科學(xué)判斷。因此，對(duì)骨質(zhì)疏松的治療不僅要考慮骨量的增加，更需要考慮改善骨質(zhì)結(jié)構(gòu)，如骨小梁的修復(fù)、重建，這一過程需要成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的協(xié)同作用。本研究采用骨組織形態(tài)學(xué)方法，對(duì)脛骨的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了觀察，以求更全面地反映針刺的治療效果。

作為衡量骨量水平的主要標(biāo)志，TBV%指的是骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，TRS%是指不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，TFS%是指有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它們可以分別判斷破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性;在一定程度上，MAR、OSW和mAR也能反映成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀況，因此它們常與TFS%一起反映骨形成的情況［19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組(OVX)大鼠脛骨TBV%(代表骨量)顯著低于假手術(shù)組，結(jié)合此模型大鼠BMD存在下降的變化，因此本研究模型造成大鼠骨量顯著減少，模型復(fù)制成功。

同時(shí)，本研究還觀察到該模型TRS%(代表骨吸收)以及代表TFS%、OSW、MAR和Mar(代表骨形成)均顯著增高，進(jìn)一步說明通過雙側(cè)卵巢切除形成的是高轉(zhuǎn)換的骨質(zhì)疏松癥模型:骨量顯著降低，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性均顯著增強(qiáng)，骨形成與骨吸收均增高(均活躍)，但骨吸收大于骨形成，該模型完全符合絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)過13周治療后針刺組大鼠脛骨TBV%明顯增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均顯著降低。與假手術(shù)組比較，盡管針刺組大鼠脛骨OSW、mAR沒有明顯差異，但大鼠脛骨TRS%、TFS%、MAR還未完全恢復(fù)正常。這一結(jié)果說明，針刺對(duì)雙側(cè)卵巢切除骨質(zhì)疏松具有治療作用，是通過增加骨量，降低骨轉(zhuǎn)換率，降低破骨細(xì)胞的活性，最終達(dá)到對(duì)骨質(zhì)疏松癥骨代謝的影響而體現(xiàn)其治療效應(yīng)。

其次，本研究針灸處方的意義在于，三陰交可調(diào)節(jié)肝、脾、腎功能，為肝、脾、腎經(jīng)的交會(huì)穴，可補(bǔ)益三臟之虛;“腎主骨”，腎氣虛衰是OP的根本病理基礎(chǔ)，取腎俞可補(bǔ)腎氣，糾正腎虛引起的OP病癥，兩穴相配可補(bǔ)益肝腎、固護(hù)先天，改善女子肝氣郁結(jié)、肝陰不足的病理狀況;同時(shí)針灸處方中配以足三里、脾俞，足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，胃腑下合穴，配以脾之脾俞，可補(bǔ)益脾胃、強(qiáng)壯機(jī)體、培補(bǔ)后天;本處方所用四穴相配，是通過對(duì)骨質(zhì)疏松癥肝、脾、腎虛虧虛病理狀態(tài)的調(diào)整，改善OP病機(jī)，從而達(dá)到改善骨骼功能的治療目的。整個(gè)治療方案較好地契合了中醫(yī)的病因病機(jī)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該腧穴配伍對(duì)臨床具有較好的參考價(jià)值。

由于條件所限，我們只做了13周的針刺干預(yù)，結(jié)果顯示針刺對(duì)骨密度的改善還未達(dá)到正常水平，我們考慮這可能是由于骨質(zhì)疏松癥是一個(gè)長期形成的過程，治療也需要漫長的過程。因此，今后的研究可考慮采取更長時(shí)間的治療周期，可以更好地凸顯針刺的治療效果，為臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考依據(jù)。考慮到針刺治療效果的整體性、多層次、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)，療效的評(píng)估除了骨密度外，還應(yīng)該對(duì)針刺治療所可能產(chǎn)生的全身整體調(diào)節(jié)作用給予深入探究。

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:1006-3250(2015)07-0857-03

2015-01-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目(81260584)-從破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)通路OPG-RANKL-RANK探討針刺治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理;中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2012M510725)-基于OPGRANK-RANKL系統(tǒng)探討針刺治療骨質(zhì)疏松癥機(jī)制

王亞軍(1970-)，男，陜西人，副教授，醫(yī)學(xué)博士后，從事針灸治療骨質(zhì)疏松癥的臨床療效評(píng)價(jià)與機(jī)理研究。