丁二酰化殼寡糖稀土配合物的抗氧化活性測定

李小芳, 馮小強 , 孫長金, 楊 聲

(1.天水師范學院 化學工程與技術學院, 甘肅 天水 741001; 2.定西師范高等專科學校 化學系, 甘肅 定西743000)

人體的衰老與病變很大程度上是由于機體內自由基產生失衡, 導致機體產生過多的活性自由基。現代科學表明, 生物相溶性與清除自由基效率是衡量抗氧化劑對機體抗氧化性能的重要指標。天然抗氧化劑因抗氧化效率高、生物相溶性良好、熱穩定性好、對機體無毒副作用等特點成為研究的熱點。殼寡糖(簡寫COS)是殼聚糖降解以后聚合度小于20的產物, 是有2~20個含氨基的葡萄糖通過β-1, 4-糖苷鍵連接而成的堿性低聚糖, 其分子質量低, 水溶性好, 理化性質均得以改善。COS由于主鏈上的β-(1, 4)糖苷鍵發生斷裂, 更多的活性羥基和氨基基團暴露出來, 因而具有良好的抗氧化能力。近年來, 低聚殼聚糖及其衍生物的抗氧化性日益受到關注。研究表明, 低聚殼聚糖羧甲基衍生物[1], 酰化衍生物[2-4]、季銨鹽衍生物[5]和硫酸酯金屬配合物[6]都有明顯的抗氧化活性。但是對低聚殼聚糖酰化衍生物稀土配合物的抗氧化活性尚未有研究報道。課題組在前期工作中, 運用紫外和熒光光譜研究丁二酰化殼寡糖稀土配合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用, 發現配合物能夠與BSA形成復合物, 從而猝滅BSA內源熒光, 該猝滅機制屬于靜態猝滅[7-8]。同時, 還采用光譜和循環伏安法, 研究了丁二酰化殼寡糖稀土配合物與鯡魚精DNA之間的作用方式, 結果發現配合物都能通過插入方式與DNA相互作用, 導致DNA分子的構象變化, 可有望成為一種新型抗癌藥物[9]。本實驗通過對殼寡糖進行酰化, 依次和不同稀土離子進行配位, 制得丁二酰化殼寡糖(簡寫 BCS)以及稀土配合物, 通過從清除羥自由基、超氧陰離子自由基和總還原能力三方面分別測定了、丁二殼酰化殼寡糖及其稀土配合物的抗氧化活性, 期望進一步尋找出更加豐富的生物功能特性, 從而拓寬殼寡糖應用范圍。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

殼寡糖(濟南海得貝海洋生物工程有限公司),分子質量5 000; 丁二酸酐(國藥集團試劑有限公司);抗氧化測試所需溶液由二次蒸餾水配制。721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 丁二酰化殼寡糖及稀土配合物的制備

根據前期已報道的具體制備方法[8]: 稱取 3.0 g COS溶于75 mL質量分數是1.0 %的乙酸溶液, 攪拌下加21 mL吡啶; 稱取2.5 g丁二酸酐, 溶于220 mL乙醇, 緩慢滴加到上述溶液中, 室溫下反應 5 h。反應液中加入 3倍體積的無水乙醇, 即刻有大量沉淀析出。抽濾, 用無水乙醇洗滌多次, 干燥得丁二酰化殼寡糖, 記作BCS。

稱取0.5 g BCS溶于適量蒸餾水中, 攪拌下逐滴加入稀土氯化物的水溶液, 室溫下攪拌3 h, 調節pH至中性, 繼續反應3 h。反應結束后加入3倍體積的丙酮, 立即析出沉淀。抽濾, 用丙酮洗滌多次直至濾液中無Cl–, 干燥得丁二酰化殼寡糖-銪、丁二酰化殼寡糖-釹和丁二酰化殼寡糖-鑭配合物, 分別記作BCS-Eu、BCS-Nd、BCS-La。分別用 1.0%(V/V)的乙酸配置成0.5 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L的溶液備用。

1.3 抗氧化活性實驗

以質量分數是1.0 %的乙酸溶液和維生素C分別為空白對照和陽性對照, COS、BCS及配合物BCS-Eu、BCS-Nd、BCS-La 對 OH、.O2–的清除作用以及還原能力的具體實驗過程, 根據已報道文獻[10]的經典實驗過程操作, 每組樣品進行 3次平行實驗,結果為平均值±標準偏差。

2 結果與討論

2.1 對·OH 的清除

·OH 是機體中產生最多的含氧自由基, 對組織細胞的破壞作用最大, 它可以加成于堿基雙鍵中造成堿基破壞, 從而產生結構突變。COS通過酰化及酰化后再與稀土金屬離子的配位作用, 從而引入了吸電子能力強的基團, 減低了分子的氫鍵作用, 使分子中的活性基團羥基和氨基大量暴露。分子中羥基上的氫與羥自由基反應, 而活性氨基則通過與溶液中的氫離子結合成氨正離子再與羥自由基形成穩定結構, 從而達到清除羥自由基的作用。

當樣品的質量濃度均為 1.0 g/L時, 維生素 C對·OH 自由基的最大清除率為 84.2 %, 而 COS、BCS、BCS-La、BCS-Nd和BCS-Eu對·OH自由基的最大清除作用分別為27.5 %、38.2 %、27.3 %、30 %和28.2 %, 說明COS、BCS及稀土離子配合物對羥自由基均具有不同程度的清除效果, 總體上 BCS及稀土離子配合物的清除效果強于COS本身(圖1), 這可能是由于在 BCS中部分氨基被取代, 盡管氨基數目在減少, 但作為吸電子基團的–COCH2=CH2COO–所起的作用占主導地位: 一方面, 它能降低 COS分子中電子云密度, 從而降低了分子內、分子間的成鍵幾率, 釋放出更多的氨基和羥基與自由基反應; 同時, 也會使O–H和N–H鍵更易斷裂, 使氨基和羥基的活性提高, 有利于清除自由基[2]。這一解釋同樣適合樣品清除超氧陰離子自由基的情況。同時還發現,隨著 BCS質量濃度的增大, 清除率逐漸降低, 可能是因為濃度過大, 分子容易扭曲團聚, 這樣暴露在外部的活性基團數量減少所致。

圖1 COS、BCS及稀土離子配合物清除·OH的能力Fig.1 Scavenging hydroxyl radical capacity of COS, BCS and complexes

但是, BCS與稀土離子配位形成配合物后, 發現對羥自由基清除能力較 BCS減弱。在低濃度時, 稀土配合物與 BCS對羥自由基清除能力差別明顯, 但隨著濃度的提高, 抑制活性很快達到飽和, 稀土配合物對羥自由基清除能力反而較 BCS增強。并且BCS-Eu、BCS-La隨著樣品質量濃度的增大, 對羥自由基清除率逐漸提高, 而BCS-Nd、BCS在質量濃度達到0.5 g/L時清除率到達最高值為37 %、47 %, 此后隨濃度增大清除率呈下降趨勢。相比之下用不同的稀土離子作配位中心對·OH 的清除作用依次是BCS>BCS-Nd>BCS-Eu>BCS-La>COS。當濃度均為0.5 g/L時, 不同稀土離子配合物清除·OH能力存在明顯差異, BCS對羥自由基的清除作用最強可達47 %。隨著濃度的增加當濃度達到 1.5 g/L時 BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu、BCS對羥自由基·OH的清除率相差不大可能是濃度過大時分子間的氫鍵作用增強影響了抗氧化效果。

2.2 對超氧陰離子自由基的清除

本實驗采用鄰苯三酚自氧化法產生超氧陰離子自由基, 用分光光度計測定各試樣在不同濃度下對超氧陰離子自由的歧化活性的吸光度值, 計算其清除率。

當樣品的質量濃度均為1.0 g/L時, 維生素C對超氧陰離子自由基的最大清除率為56.8 %, 而COS、BCS、BCS-Nd、BCS-Eu和BCS-La的最大清除作用分別為15 %、17 %、19 %、21 %和20.8 %, 說明COS、BCS及稀土離子配合物對超氧陰離子自由基均具有不同程度的清除效果, 總體上 BCS及稀土配合物的清除效果強于 COS本身, 在不同濃度下稀土配合物對超氧陰離子自由基清除效果普遍強于 BCS(圖2),這可能是由于 BCS與稀土離子配位后, 分子上電荷密度增大, 更加有利于與超氧陰離子自由基作用。當樣品的質量濃度均為1.5 g/L時, 對超氧陰離子自由基的清除作用依次為 BCS-La>BCS-Eu>BCS-Nd>BCS>COS。其中BCS-Nd、BCS-Eu在試樣質量濃度0.5 g/L時清除作用最強, 清除率分別為22.5 %、26.5 %,此后濃度與清除率呈負相關趨勢。而對于COS、BCS和BCS-La, 濃度與清除率趨于正相關。據圖2所示,酰化殼寡糖及酰化殼寡糖稀土配合物對清除超氧陰離子自由基能力較COS顯著提升。

圖2 COS、BCS及稀土離子配合物對·O2-的清除Fig.2 Scavenging superoxide anion radical capacity of COS, BCS and complexes

2.3 還原能力測定

還原能力是表示抗氧化物質提供電子能力的重要指標, 研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關系。實驗采用鐵氰化鉀法測定試樣在700 nm的吸光度, 來間接反映還原能力的強弱。一般吸光度值越大, 則還原能力越強。如圖3所示,BCS、BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu的還原能力均比COS略有增強, 但不同稀土配合物間的還原能力相差不大, 可能是所選配位中心離子同屬鑭系元素,具有相似的化學性質的緣故。而且試樣質量濃度在0.5~1.5 g/L的范圍內隨著濃度的增大, 還原能力也隨之增強。

圖3 COS、BCS及稀土離子配合物的還原能力Fig.3 Reducing power of COS, BCS and complexes

3 結論

從清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基和還原力三個體外抗氧化實驗, 可以看出BCS、BCS-La、BCS-Nd、BCS-Eu較COS均具有很好的抗氧化能力,表現出了不同程度的抗氧化能力。在COS分子鏈上引入吸電子基團–COCH2=CH2COO–后, 降低COS分子中電子云密度, 從而降低了分子內、分子間的成鍵幾率, 釋放出更多的氨基和羥基與自由基反應, 所以BCS的抗氧化活性較COS增強。稀土配合物中,由于不同種類稀土離子的引入, 分子中電子云密度增大, 更加有利于進攻自由基, 故而抗氧化活性較BCS增強。

[1] 孫濤, 銀旭紅, 姚倩, 等.低聚羧甲基殼聚糖的抗氧化性能[J].海洋科學, 2010, 34(2): 54-56.

[2] 孫濤, 銀旭紅, 甘建紅, 等.不同取代度 N-馬來酰低聚殼聚糖的抗氧化活性的研究[J].天然產物研究與開發, 2010, 22: 890-893.

[3] 李銘, 熊小燕, 謝晶, 等.N-琥酰低聚殼聚糖的抗氧化性能研究[J].天然產物研究與開發, 2014, 26:1680-1684.

[4] 孫濤, 銀旭紅, 謝晶, 等.不同取代度 N-鄰苯二甲酰殼聚糖抗氧化活性的研究[J].天然產物研究與開發,2011, 23: 713-716.

[5] Guo Z Y, Xing R G, Liu S, et al.Synthesis and hydroxyl radicals scavenging activity of quaternized carboxymethyl chitosan[J].Carbohydr Polym, 2008, 73:173-177.

[6] 劉松, 邢榮娥, 蔡圣寶, 等.殼聚糖硫酸酯金屬配合物的抗氧化活性[J].海洋科學, 2009, 33(11): 11-14.

[7] 李小芳, 馮小強, 楊聲, 等.丁二酰化殼寡糖鑭配合物的合成及與牛血清白蛋白的相互作用[J].光譜實驗室, 2013, 30(3): 1211-1215.

[8] 李小芳, 馮小強, 楊聲, 等.丁二酰化殼寡糖銪配合物的合成及與牛血清白蛋白的相互作用[J].發光學報, 2012, 33(8): 905-910.

[9] 李小芳, 馮小強, 楊聲, 等.丁二酰化殼寡糖稀土配合物與鯡魚精DNA相互作用的電化學及光譜學研究[J].發光學報, 2013, 34(12): 1662-1666.

[10] 李小芳, 馮小強, 楊聲, 等.硫脲殼聚糖金屬配合物的抗氧化活性研究, 天然產物研究與開發[J].2012,24: 1813-1815.