長鏈非編碼RNA-HOTAIR與乳腺癌腋窩淋巴結轉移相關性研究

王昌亮 王禮泉 林明臻 孫香蓮 翟升永

長鏈非編碼RNA（large intervening non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，他們本身并不編碼蛋白質，而常以RNA的形式調控基因的表達，包括表觀遺傳學調控，轉錄調控，轉錄后調控等[1-2]。最初研究認為lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄副產物[3]，然而近年來的研究提示其生物學功能廣泛且參與多種重要的調控過程如染色質修飾、轉錄激活以及核內運輸等等。HOTAIR是lncRNA的成員之一，與腫瘤發生發展關系密切[4-5]，其在乳腺癌中的研究限于對某些蛋白的表達調控[6]。本實驗研究探索HOTAIR在乳腺癌組織及前哨淋巴結中的表達情況，為乳腺腫瘤的基因治療提供新策略。結合臨床病理資料分析，指導治療及預測預后。

1 材料與方法

1.1 實驗對象入組標準及標本來源

1.1.1 實驗對象入組標準 所有入組患者均簽署知情同意書，實驗研究符合倫理學原則。收集濰坊市人民醫院乳腺外科2013年6-年12月住院患者，行乳房手術+前哨淋巴結活檢術，術前穿刺病理診斷為乳腺浸潤性癌，取乳腺癌組織、癌旁組織，癌旁組織選取乳腺非同一象限經病理證實為正常乳腺組織。前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）探測儀結合亞甲藍染料檢出SLN≥2枚且術中冰凍病理示SLN有轉移的患者入組，進而行常規腋窩淋巴結（Axillary lymph node，ALN）清掃。標本來源均為女性，年齡32~51歲，平均42.2歲。術后常規病理證實為浸潤性導管癌，SLN轉移數目不少于2枚，ALN轉移率低于100%，獲得SLN（+）組10例，ALN（-）組10例，乳腺癌組織組10例，癌旁組織組10例。記錄患者年齡、前哨淋巴結（SLN）數目、腋窩淋巴結（ALN）數目、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、C-erbB-2、P53以及ki-67。淋巴結轉移數分組采用N1、N2、N3（無N0患者）；淋巴結轉移率（10%，10%~50%，50%）；ki-67表達（14%，14%~75%，75%）。

1.1.2 標本處理及保存 取前哨淋巴結，縱向等大剖開，一半冰凍檢查，另一半RNAlater solution（購自AMBION公司）保存，留作提取RNA使用。冰凍檢查示有癌組織轉移，則另一半繼續進行實驗操作。腋窩淋巴結組取未轉移淋巴結，剖開保存。癌組織、癌旁組織相同實驗處理。所有標本均為新鮮標本，簡單切碎組織樣本，任何一邊的最大厚度不超過0.5 cm，RNAlater液5倍于組織碎塊并完全浸沒，-80 ℃長期保存。入組病例臨床病理資料見表1。

表1 入組患者臨床病理資料

1.2 總RNA提取及質量判斷

1.2.1 總RNA提取 異硫氰酸胍-苯酚（Trizol， 購自INVITROGEN公司）法提取總RNA：裂解細胞獲得核酸，利用DNA和RNA在特定pH時溶解度不同，通過有機溶劑抽提沉淀RNA。-80 ℃冰箱保存組織樣本室溫下解凍，組織塊放入處理好的EP管稱重，一次提取的組織塊重量在0.05~0.1 g之間，并做好記錄。進行RNA提取，并防止DNA污染。

1.2.2 RNA質量判斷 分光光度儀進行RNA定量，計算OD260/OD280比值，范圍在1.8~2.0為滿意純度。記錄RNA濃度，總體RNA濃度范圍（2.1946±0.7765）μg/μL。RNA電泳符合標準即：有清晰地18S、28S條帶，RNA無降解，且肉眼觀察28S條帶亮度是18S條帶亮度的1~2倍，進行RNA逆轉錄。

1.3 RNA逆轉錄、lncRNA-HOTAIR的實時熒光定量

1.3.1 實時熒光定量反應試劑及引物準備 HOTAIR序 列：（Forward）GGGGCTTCCTTGCTCTTCTTATC；（Reverse）GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，β-ACTIN（內參）序列：（Forward）CCTGTACGCCAACACAGTGC；（Reverse）ATACTCCTGCTTGCTGATCC。逆轉錄反應試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及引物序列均購自INVITROGEN公司。使用美國ABI公司的實時熒光定量儀：ABI-7500HT。

1.3.2 逆轉錄及實時熒光定量反應 （1）采用INVITROGEN公司的逆轉錄反應試劑盒（5×RT Reaction Buffer、Enzymes mix、Rnase-free ddH2O），低溫解凍，逆轉錄反應溶液振蕩混勻后離心，加模板RNA到混合液中混勻，離心收集管壁殘留液體，42 ℃水浴反應1小時95 ℃水浴5分鐘完成逆轉錄。逆轉錄產物4℃保存進行RT-PCR。（2）使用INVITROGEN公司的熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green master mix、PCR primer mix、ROX Reference Dye），進行熒光定量，每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，監測PCR產物量的變化，得到模板RNA逆轉錄后PCR擴增曲線圖三個階段：基線期、對數期和平臺期。對熒光曲線的指數擴增階段進行定量分析。

1.4 統計學處理 采用美國ABI公司SDS 1.4軟件處理實驗結果。統計學分析采用t檢驗、Spearman等級相關分析等進行處理。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量檢測長鏈非編碼RNA-HOTAIR在各組中的表達情況。待測HOTAIR量通過軟件計算以-△△CT表示相對表達量。各組中HOTAIR表達情況見表2。

表2 HOTAIR在各組中的相對表達量

2.2 前哨淋巴結（SLN）中HOTAIR表達情況與患者臨床病理指標關系分析 分析實時熒光定量結果與臨床病理指標關系提示：HOTAIR與淋巴結轉移率存在相關性，表現為淋巴結轉移率高，HOTAIR表達升高（相關系數r=0.65；P=0.03）；另外ki-67蛋白高表達癌組織，對應SLN中HOTAIR表達量越高，呈直線相關（相關系數r=0.80；P<0.01）。而HOTAIR表達量與淋巴結轉移數目、年齡、ER、PR、C-erbB-2以及P53無明顯相關性。資料見表3。

表3 SLN中HOTAIR表達情況與臨床病理指標間的關系

3 討論

長鏈非編碼RNA HOTAIR是HoxC基因簇的一條反義鏈，是一個長度為2.2 kb的基因，定位在哺乳動物12q13.13上HOXC位點，不編碼任何蛋白質。目前HOTAIR被人們所認識的作用機制是特異性結合多梳抑制復合體2（PRC2），HOTAIR可至少連接兩個不同的組蛋白修飾復合物，從而充當一個腳手架的作用，如其5’端區連接PRC2 復合物，負責H3K27 的甲基化；3’區連接LSD1（組蛋白賴氨酸去甲基化酶）介導H3K4me2 的去甲基化。抑制相關基因的表達，使得染色體特定區域發生甲基化，引發異染色質形成或基因沉默而致病[7]。研究發現HOTAIR通過在上皮-間質轉化（EMT）過程中調控Snail蛋白的表達，對腫瘤細胞增殖、凋亡作用顯著[6，8]。越來越多的LncRNA被證明在細胞水平和分子遺傳學水平具有相應的功能，包括劑量補償效應、參與基因組印記過程、組蛋白修飾、染色質重構、細胞分化、細胞結構的完善、細胞周期的調控、細胞內物質的運輸、干細胞的程序再編以及熱休克反應，作為微小RNA（miRNA）的前體等[9]。LncRNA的這些作用已引起人們的廣泛關注，其中既有順式調控作用，又有反式調控作用的HOTAIR在癌癥中異常表達，已成為癌癥方面非編碼RNA研究的一個新的熱點，但作用機制尚不十分清楚[10]。

本實驗研究中，HOTAIR在前哨淋巴結組以及癌組織組中表達量異常升高，提示HOTAIR在惡性腫瘤細胞的侵襲轉移發生發展方面關系密切。

Gupta等[9，11-13]研究發現HOTAIR在乳腺癌遠處轉移灶中表達顯著升高，并認為HOTAIR是預測腫瘤轉移和預后的重要指標。本實驗研究中前哨淋巴結HOTAIR異常高表達，提示其作為乳腺癌基因治療新靶點的可行性。可為前哨淋巴結陽性患者，術后輔助化療同時，給予基因靶向治療。臨床病理資料分析顯示HOTAIR在影響患者術后治療方案選擇、預測預后有一定作用。HOTAIR表達量與腋窩淋巴結轉移率有相同的變化趨勢，表現為ALN%越高，HOTAIR表達量增加。ki-67反應惡性腫瘤增殖活性大小。乳腺癌中ki-67也作為預后指標之一，ki-67陽性表達越高，預示細胞增殖活躍，侵襲轉移幾率高，預后差[14]。實驗中HOTAIR基因與ki-67蛋白表達呈正相關，與文獻報道相似[15]。但其他臨床病理指標未顯示明顯相關，需擴大樣本量進一步研究。

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