原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體誘導AD海馬神經元的保護作用

李智勇，羅 漢，張海英

（1.海口市人民醫院神經外科，海南 海口 570208；2.海南醫學院人體解剖學教研室，海南 海口 571101）

·論 著·

原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體誘導AD海馬神經元的保護作用

李智勇1，羅 漢1，張海英2

（1.海口市人民醫院神經外科，海南 海口 570208；2.海南醫學院人體解剖學教研室，海南 海口 571101）

目的 應用Aβ1-42寡聚體誘導SD胎鼠海馬神經元制備細胞損傷模型，觀察海南益智仁提取物-原兒茶酸(PCA)對模型細胞的保護作用。方法采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)檢測細胞活力，流式細胞技術檢測細胞凋亡，蛋白質印跡法(Western blot)檢測ERK蛋白，觀察原兒茶酸對模型細胞的保護作用。結果Aβ1-42寡聚體干預SD胎鼠海馬神經元后,神經元生存率下降，神經元凋亡率升高，ERK蛋白表達下調。添加原兒茶酸后，模型細胞存活率改善明顯、凋亡率顯著性降低，且呈現濃度依賴性，并且ERK蛋白表達上調。結論原兒茶酸可拮抗Aβ1-42寡聚體所誘導的海馬神經元損傷，具有神經保護作用。

阿爾茨海默病；Aβ1-42寡聚體；原兒茶酸；ERK信號通路

阿爾茨海默病(AD)的防治具有積極的社會意義，中醫藥在AD防治中具有獨到的地位和廣闊的前景。研究發現，益智仁提取物-原兒茶酸(Protocatechuic acid，PCA)為天然酚酸類化合物，是益智仁的有效活性成分，具有良好的抗氧化作用[1]。前期研究發現，PCA對的缺血、缺氧神經元具有一定的保護作用[2]。本實驗以Aβ寡聚體誘導AD神經元損傷模型，觀察原兒茶酸對AD海馬神經元損傷的保護作用，探討可能的作用機制，找到AD防治的新途徑和新策略，為進一步開發南藥益智仁新的藥用價值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 益智仁提取物-原兒茶酸由海南醫學院實驗室分離、純化，經HPLC檢測，純度不低于98%，兔抗鼠ERK多克隆抗體購自美國Bioworld公司，Aβ1-42購自sigma公司，JC-1 Kit購自Molecular Probe公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞模型的制備及分組 Aβ1-42溶于預冷的六氟異丙醇中，室溫孵育1 h，使之單體化，隨后蒸發六氟異丙醇，殘留的肽置于-80°C冰箱，隨后溶于無水的二甲基亞砜中，濃度為5 mmol/L，與F12混勻，濃度為100 μmol/L，置4℃～8℃老化24 h，14 000×g離心10 min，可溶的Aβ寡聚體浮于上層，吸取上層液體，稀釋后用以實驗。1只SD大鼠孕(18±2)d，取胎鼠海馬神經元培養14 d后，添加Aβ1-42寡聚體10 μmol/L干預24 h造模。實驗分為五組：空白組(CTL)，空白組加入含10%胎牛血清的DMEM維持液；Aβ1-42模型組(Aβ1-42)；PCA組(3亞組濃度分別為：Aβ1-4210 μmol/L+PCA 0.1 μmol/L(PCA1組)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 1.0 μmol/L (PCA 2組)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 10 μmol/L(PCA 3組)，先給予PCA 0.5后，再添加Aβ1-42oligomer繼續培養24 h，檢測各項指標。

1.2.2 PCA對細胞模型活力的影響 采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)實驗，海馬神經元以5×105/ml植入96孔板，根據實驗分組分別加入干預因素，置CO2孵箱8 h、12 h、24 h后，各孔加入10 μl MTT，培養4 h后，去除培養液，添加200 μl二甲基亞楓，顆粒溶解后使用酶標儀，在490 nm的吸光值下，檢測各組的吸光度。

1.2.3 流式細胞儀分析 實驗各組干預24 h后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次，重新懸浮細胞至1×106/L，取100 μl細胞液，添加5 μl異硫氰酸熒光素標記的Annexin V和10 μl碘化丙錠混勻。置室溫，避光靜置15 min，各管加入400 μl結合緩沖液，1 h內進行流式細胞分析。激發波長為488 nm，計數104個細胞。所有數據均經Cell Qust軟件收集處理。

1.2.4 Western blot檢測 實驗各組干預24 h后，收集細胞，PBS清洗3次，100 mm培養皿內加200μl細胞裂解液，置于冰上裂解20 min，15 000 r，4℃離心10 min，取上清液，蛋白定量。以10%SDS電泳分離，半干電轉至NC膜，室溫封閉2 h后，加入一抗ERK多克隆抗體，1:500稀釋；4℃過夜，抗羊IgG二抗(1:1 000稀釋)反應2 h，實驗重復3次，GAPDH為內參照。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，參數值以均值±標準差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCA對實驗各組細胞活力的影響 采用MTT檢測PCA對實驗各組細胞的影響，發現PCA對Aβ1-42模型組細胞損傷具有保護作用。Aβ1-42模型組與PCA組相比較，A值差異具有統計學意義(P＜0.05)，細胞活力隨PCA濃度的升高有所改善，呈一定的濃度依賴關系(量效關系)，見表1。

表1 各實驗組對模型細胞存活率的影響(±s，n=6次)

表1 各實驗組對模型細胞存活率的影響(±s，n=6次)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別 吸光值(A490) 8 h 12 h 24 h Aβ1-42模型組PCA1組PCA2組PCA3組F值P值0.532±0.013 0.647±0.012a0.681±0.038a0.717±0.016a67.34 0.000 0.496±0.021 0.653±0.016a0.705±0.042a0.734±0.039a91.93 0.000 0.464±0.017 0.671±0.024a0.726±0.039a0.723±0.048a147.66 0.000

2.2 PCA對細胞模型凋亡的影響 采用流式細胞技術檢測PCA對模型細胞凋亡的影響，結果顯示，Aβ1-42模型組凋亡率明顯上升，與PCA組相比較，差異具有統計學意義(P＜0.05，見圖1)。

圖1 PCA對細胞模型凋亡的保護作用

2.3 PCA對ERK蛋白表達的影響 采用Western blot檢測PCA對ERK蛋白表達的影響，結果顯示，Aβ1-42模型組ERK蛋白表達下調，PCA各實驗組ERK蛋白表達上調。

圖2 PCA對ERK蛋白表達的影響

3 討 論

當前，我國人口進入老齡化階段，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的發病率呈逐年上升趨勢。AD的發病機理很復雜，其中Aβ(β-amyloid protein)級聯學說認為，淀粉前體樣蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的酶切代謝產物Aβ在AD發病早期起主要的作用。本實驗結果發現，Aβ1-42寡聚體致使海馬神經元活力下降，神經元凋亡增加，ERK表達下降，而原兒茶酸可以有效的改善海馬神經元的活力，減少神經元凋亡，增加ERK表達。由此可以說明，原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體損傷的海馬神經元具有一定保護作用。

細胞外信號調節激酶(Extracellular signal regulated kinase，ERK)參與細胞凋亡信號途徑的一類信號分子，與AD的發病機制相關，與海馬區學習記憶功能有密切聯系[3]。ERK屬于一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族的一個重要成員，ERKl、 ERK2分子量分別為44 kD和42 kD。MEK(MAP kinase kinase)為MAP2K家族成員，有MEK1和MEK2兩種亞型，分子質量分別為44 kD和45 kD，通過磷酸化酪氨酸/蘇氨酸(Tyr/Thr)殘基，進而激活下游底物ERK1/2。ERK下游的MAPKAPK主要是90 kD核糖體S6激酶，轉位進入細胞核并磷酸化一系列底物，如c-Fos、帽結合蛋白(Cap binding protein，CBP)等[4]。有研究發現，神經元損傷發生后，ERK在神經損傷的區域激活，減少細胞凋亡，從而縮小創傷范圍，降低對機體的影響[5]。本研究結果顯示Aβ1-42寡聚體可以增加海馬神經元的凋亡率。分子生物學機制的研究結果表明，加入Aβ1-42寡聚體24 h后，海馬神經元ERK蛋白表達水平下降；給予原兒茶酸干預后，ERK蛋白表達水平升高。結果提示，Aβ1-42寡聚體可造成海馬神經元的損傷，而神經元損傷的機制可能與ERK信號通路有關，并且原兒茶酸的神經保護作用可能參與ERK蛋白的表達。

綜上所述，原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體誘導的海馬神經元損傷具有保護作用，且原兒茶酸的藥物作用機制與ERK信號轉導途徑有關。因此，益智仁提取物-原兒茶酸在AD治療中具有一定的潛在應用價值，但其作用機制還需要進一步的深入研究。

[1]Zhang X,Shi GF,Liu XZ,et al.Anti-ageing effects of protocatechuic acid from Alpinia on spleen and liver antioxidative system of senescent mice[J].Cell Biochem Funct,2011,29(4):342-347.

[2]李智勇,夏 鷹,陳曉東,等.益智仁提取物原兒茶酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].海南醫學,2013,24(2): 157-159.

[3]吳 哲,趙艷華,彭 博,等.堿性成纖維細胞生長因子對AD細胞模型ERK1/2活性的影響[J].解剖科學進展,2011,17(3): 300-303.

[4]趙明哲,劉靖華,李玉花,等.ERK信號通路的信號轉導調控機制[J].國際病理科學與臨床雜志,2009,29(1):15-19.

[5]陶 昕,孟祥志,孫 麗,等.MAPK信號通路與神經系統損傷的研究進展[J].解剖科學進展,2010,16(6):574-577,582.

Protective effect of protocatechuic acid on AD hippocampl neurons treated with Aβ1-42oligomer.

LI Zhi-yong1, LUO Han1,ZHANG Hai-ying2.1.Department of Neurosurgery,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan, CHINA;2.Department of Anatomy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of protocatechuic acid(PCA)fromAlpinia oxyphyllain Hainan on nerve cell injury models,which were established by incubating hippocampl neurons of SD fetal rats in the presence ofβ-amyloid 1-42(Aβ1-42)oligomer.MethodsWith cell viability detected by MTT,apoptosis detected by flow cytometry and ERK protein detected by Western blot,the protective effect of PCA on nerve cell injury models was observed.ResultsAfter intervention by Aβ1-42oligomer.the viability of hippocampl neurons were decreased;The apoptotic rate increased;ERK protein expression was down-regulated.However,after the addition of PCA,the viability of hippocampl neurons significantly improved and the apoptotic rate significantly reduced,with dose-dependent effect.The expression of ERK protein was also up-regulated.ConclusionPCA had a significant protective effect against Aβ1-42oligomer-induced injury.

Alzheimer's disease;Aβ1-42oligomer;Protocatechuic acid(PCA);ERK signal pathway

R-332

A

1003—6350（2015）14—2029—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0735

2015-01-12)

國家自然科學基金(編號：81100246)；海南省自然科學基金(編號：811204)；海口市重點科技計劃項目(編號：2011-0135)

張海英。E-mail：hyzhang_xjtu@yahoo.cn