掃描電子顯微鏡校準方法

張欣宇，凌珊，封小亮，沈小艷

(1.廣東省計量科學研究院，廣東廣州510405，2.廣東省現代幾何與力學計量技術重點實驗室，廣東廣州510405;3.華南理工大學，廣東廣州510640)

0 引言

掃描電子顯微鏡(簡稱掃描電鏡)是用于微觀形貌觀察和顯微結構分析的大型分析儀器，在材料科學、生命科學、微電子、半導體工業等領域應用廣泛。由于掃描電鏡分析時采用電子束逐點、逐行掃描，掃描圖像的質量受掃描電子線路影響，易出現圖像放大倍率偏差、XY 方向圖像畸變以及測長不準等問題［1］。掃描電鏡作為納米材料和微納米結構尺寸表征的重要工具，其長度測量值也需要能夠溯源，因此有必要對掃描電鏡進行校準。

1988年發布的JJG550-88《掃描電子顯微鏡試行檢定規程》規定了對掃描電鏡放大倍數示值誤差、放大倍數重復性、圖像的線性失真度(圖像畸變程度)、二次電子像分辨本領的檢定要求［2］。隨著科技的不斷進步和電子顯微技術的飛速發展，尤其是高分辨力場發射掃描電鏡的日益普及，該規程提出的技術指標以及部分檢定方法已不適合現今的儀器實際需要，但已近三十年，該規程未進行過修訂。國家教委于1997年頒布了JJG(教委)010-1996《分析型掃描電子顯微鏡檢定規程》，該規程在國家計量檢定規程基礎上對分析型掃描電鏡進行了明確分類，對不同類型掃描電鏡的技術指標分別予以規定，而且增加了作為掃描電鏡重要附件的X 射線能譜儀的技術指標和檢定方法［3］。上述兩個規程發布和實施的年代均較早，當時用于校準掃描電子顯微鏡的標準器基本都需要進口，且可供選擇的標樣類型也非常少，雖然兩個規程都提出了比較科學、有效地評價掃描電鏡計量性能的重要指標，但并沒有統一所使用的標準器以及明確測量方法，一直以來，掃描電鏡的檢定過程無法實現統一，結果評價也無法實現一致。

1 標準器現狀

可用于校準掃描電鏡的標準器主要有一維和二維物理光柵、線寬、線間距樣板、二維柵格樣板、緊密排列的亞微米粒子標準樣品以及碳表面鍍金顆粒標樣等。早期可用的標準樣品非常有限，國內基本沒有成熟的標樣可供使用，國外也僅有美國國家標準技術研究院(NIST)提供的掃描電鏡標準參考物質SRM 系列標樣、德國PTB 發布的IMS-HR94 175-04 以及英國Agar科學公司提供的傳統方格標準樣品(2160 線/mm)等幾種類型標樣，這些標樣普遍存在溯源精度不高、尺寸單一、僅單向尺寸和使用不便等不足。隨著掃描電鏡校準標樣的需求日益增多以及標樣制作技術水平的提升，國外可供選擇的商品化標準樣品逐漸增多，如美國TEDPELLA.INC.的碳復型平行/網狀格柵(2160 線/mm)以及單晶硅網狀格柵(間距10 μm)、美國Advanced Surface Microscopy，Inc.的一維納米線間隔樣板、美國GELLER MICROANALYTICAL LABORATORY的MRS-4 系列多功能標樣等。

國內近年來已開展多種類型校準標樣的研究工作。中國計量科學研究院錢進等提出利用一維光柵標樣校準掃描電子顯微鏡的方法并對測量原理進行了實驗研究［4］，利用600 線/mm、800 線/mm 和2400 線/mm 三種規格的一維復制光柵樣品對10 臺掃描電鏡2000 倍～40000 倍的放大倍數進行校準，光柵參考線距通過線距標準裝置溯源于復現國際單位制的He-Ne激光波長(國家長度基準);實驗結果表明，所使用的一維光柵標樣能夠滿足105倍以下掃描電鏡標尺的量值溯源要求。中國地質科學院礦產資源研究所周劍雄等利用電子探針和計量型掃描力顯微鏡(M-LRSFM)分別對標樣的均勻性、穩定性進行研究，并研制了微米- 百微米級柵網、微米- 亞微米級圖形、100nm 以下的一維或二維光柵三種類型標準樣品［1，5-6］;結果表明樣品可用于掃描電鏡圖像的放大倍率校準、圖像畸變校驗以及相同量級長度的比對測量等。上海市計量測試技術研究院盛克平等報道了用有證標準粒子研制成緊密排列的亞微米標準樣品，并對標準樣品進行不確定度評估［7］;結果表明研制的球形粒子緊密排列標樣適用于校準1000 倍～10 萬倍的掃描電鏡放大倍數。中國計量科學研究院邵宏偉等研究了可溯源至激光波長的微米、納米顆粒國家標準測量裝置，它利用掃描電子顯微鏡高倍數放大、對準和定位顆粒影像，采用納米位移掃描工作臺和激光干涉儀測量微米、納米量級的標準顆粒直徑，為球形粒子直徑量值溯源到長度計量基準(激光光波波長)提供了一種有效地途徑［8］。

圖1 給出了掃描電鏡校準中常見的標準樣品類型。

圖1 掃描電鏡校準中常見的標準樣品類型

圖1 中，a 為邊長50 μm 的銅柵網標樣;b 為線間距10 μm 的SiO2/Si 網狀格柵標樣;c 為1 μm 線間距同心矩形方格標樣;d 為0.5 μm 的平行線間距標樣;e 為用于校準二次電子像分辨力的碳表面鍍金顆粒標樣;f 為直徑300 nm 的球形粒子緊密排列標樣。

2 校準方法

結合作者已在國內開展的實際校準工作，對掃描電鏡幾個主要技術指標的校準方法進行探討。所使用的校準標樣為國外購置的GELLER MICRO ANALYTICAL LABORATORY MRS- 4.2 多功能標樣(含0.5，1，2，50 μm 和500 μm 五個基本尺寸)及TED PELLA.INC.單晶硅網狀格柵標樣(間距為10 μm)兩種。

2.1 放大倍數校準

JJG 550-88 和JJG(教委)010-1996 中均規定掃描電鏡放大倍數的示值誤差用相對值來表示，計算公式為

式中:N 為放大倍數標稱值;M 為放大倍數實測值。

早期的掃描電鏡缺少高分辨力的顯示設備，需要通過拍照并打印輸出圖像，再利用比長儀在圖像上測量標樣的實際尺寸，除以標樣尺寸的校準值，得到掃描電鏡放大倍數實測值M。由于在輸出和打印時圖像不可避免地出現失真和變形，將造成獲得的圖像實際放大倍數必定與標稱倍數存在差異。現代的掃描電鏡已配有大尺寸、高分辨力的顯示屏，測量結果一般都以電子圖像保存，極少直接打印紙質的電鏡圖片。因此，已有規程中給出的檢定方法已不適合現代掃描電鏡放大倍數的實際校準。

由于電子圖像在顯示設備中可隨意放大或縮小，計算放大倍數的絕對值沒有實際意義。圖像上的放大倍數顯示值可能與最終圖像的放大倍數無關，而顯微標尺是關聯測量圖像與標準樣品并計算最終圖像放大倍率的唯一顯示值，因此放大倍率的校準僅是對顯微標尺進行校準［9］。

校準掃描電鏡的放大倍數實際就是校準電子圖像中標尺所顯示的放大倍數誤差。使校準標樣和標尺呈現的同一幅電子圖像中，則校準標樣顯示的實際放大倍數和標尺顯示的放大倍數分別為

式中:a 為標尺在圖像中的實際尺寸;a'為標尺的標稱尺寸;s 為校準標樣在圖像中的實際尺寸;s'為校準標樣的已校準尺寸。

則掃描電鏡在該放大倍數下的示值誤差為

根據公式(2)可知，放大倍數的示值誤差只與圖像中標尺和校準標樣實際測量尺寸的比值a/s 相關，因此只需計算該比值，即可得出掃描電鏡放大倍數示值誤差，避免了需要計算圖像實際放大倍數的問題。在日常校準中，針對掃描電鏡的電子圖像，我們采用測量電子圖像原始像素比值的方法計算標尺和校準標樣實際長度的比值，減少了在顯示屏上直接利用長度測量儀器進行絕對長度測量時所帶入的測量儀器本身誤差和人為誤差，從而提高了放大倍數示值誤差的校準精度。如圖2所示，利用Photoshop 專業圖像處理軟件，在掃描電鏡原始電子圖像上測量校準標樣5 個格柵間距和標尺長度所包含的像素值分別為851 和175，標樣校準值和標尺的標稱值分別為2.5 μm 和0.5 μm，根據公式(2)計算得到放大倍數為10 萬倍時，掃描電鏡的放大倍數示值誤差為+2.8%。

圖2 Photoshop 軟件中利用原始電子圖像像素值計算放大倍數誤差

2.2 放大倍數重復性

根據掃描電鏡的實際使用情況，選取某個常用的放大倍數并相應選取適合的校準標樣，按正常的操作程序拍攝標樣的第一張電子圖片，改變電子束的加速電壓，5 min 后恢復到第一張照片時的設置，拍攝標樣的第二張照片，重復上述操作，在45 min 內共拍攝10張照片。利用Photoshop 軟件對獲得的原始圖片進行分析，分別計算10 張圖片上標樣間距所包含的像素值以及像素值的平均值，利用像素值代替實際長度測量值進行放大倍數示值重復性的計算。放大倍數重復性g計算公式為

式中:Pi為第i 張圖像中，標樣間距包含的像素值(i=1，2，3，…，10);為標樣間距包含的像素值平均值;n 為電子圖像數(n=10)。

圖3 Photoshop 軟件中利用原始電子圖像像素值計算放大倍數重復性

如圖3所示，選用MRS 標樣中1 μm 柵格的3 個間距值為考察對象，在4 萬倍放大倍數下依次拍攝10張電子照片，用Photoshop 軟件分別對間距值包含的像素值進行測量，結果見表1。根據公式(3)計算得到，4 萬倍放大倍數下，掃描電鏡的放大倍數重復性為1.0%。

表1 利用像素值計算掃描電鏡放大倍數重復性表

2.3 圖像線性失真度

現有規程中要求圖像線性失真度的檢定應選取放大倍數100 倍，標準器為邊長0.1 mm 的正方形金屬網格，但沒有對網格尺寸的允許誤差予以規定。這可能是由于起草規程時沒有尺寸更小、相應允許誤差更小的標準器可以獲得。雖然有文獻報道，掃描電鏡在低倍下圖像畸變更嚴重，但筆者認為，僅在100 倍的放大倍數下考察掃描電鏡的圖像線性失真度過于片面，應針對實際使用情況，在儀器最常使用的放大倍數范圍內校準最為恰當。

將標樣某一特征尺寸置于顯示器中心和四角分別拍攝照片，利用Photoshop 軟件分別對5 張電子圖像中特征尺寸在X，Y 兩個方向上包含的像素值進行測量，再通過公式(4)，(5)計算圖像線性失真度。

式中:Px0為中心位置處X 方向上柵格間距包含的像素值;Pxi為圖像i 位置處(i=1，2，3，4)X 方向上柵格間距包含的像素值;ΔPx，max為最大值，ΔPxi=Pxi-Px0，

式中:Py0為中心位置處Y 方向上柵格間距包含的像素值;Pyi為圖像i 位置處(i=1，2，3，4)Y 方向上柵格間距包含的像素值;ΔPy，max為最大值，ΔPyi=Pyi-Py0。

如圖4所示，選用10 μm 間距的柵格，在3000×放大倍數下計算XY 方向的圖像線性失真度(特征柵格選擇中間有一凹坑，邊緣有一顆粒的柵格用以明顯區別其它柵格)。通過Photoshop 軟件測量標樣中特征柵格在顯示屏各位置處間距所包含的像素值，結果見表2。

圖4 標樣特征柵格在顯示屏不同位置處的電子圖像

表2 利用像素值計算X，Y 方向圖像線性失真度表

根據計算結果，3000×放大倍數下，掃描電鏡電子圖像X 方向線性失真度為1.1%，Y 方向線性失真度為0.7%。

3 建議

掃描電鏡作為現代科學研究及技術應用中普遍使用的分析和測量工具，應抓緊進行現有國家計量技術法規的修訂，并用以指導儀器的實際校準，確保掃描電鏡計量性能的穩定與可靠。計量校準規范中，除應繼續保留掃描電鏡電子圖像質量的評價指標如放大倍數示值誤差、放大倍數示值重復性、XY 方向圖像線性失真度以外，還應考慮以下幾個問題:

3.1 二次電子像的分辨力校準

現有規程中規定利用碳表面噴鍍金顆粒的標樣，在最佳工作狀態下，在一定放大倍數下拍攝金顆粒的二次電子圖像，測量照片上可分辨的金顆粒邊界的最小間距除以當前的放大倍數計算掃描電鏡二次電子圖像的分辨力。但在實際校準過程中，分辨力的精確測定比較困難，一方面越接近掃描電鏡極限放大倍數，金顆粒邊界越模糊，界定顆粒邊界非常困難，邊界之間的最小距離也難以準確計算;另一方面，“可分辨”的要求人為因素影響大，很難據此獲得準確的評價。

3.2 長度測量誤差校準

現代掃描電鏡均自備測量程序，可進行微納米幾何尺寸的直接測量，因此有必要評價不同放大倍數下掃描電鏡長度測量的準確性。對長度測量示值誤差進行校準，也可以用于實際被測樣品的長度測量值進行修正，這也是國家標準中利用掃描電鏡進行納米級長度測量時的要求［10］。可直接利用經過校準的線寬、線間距、格柵型等標準樣品對掃描電鏡長度測量示值誤差進行校準。

3.3 X 射線能譜儀的校準

X 射線能譜儀是分析型掃描電鏡必備的重要附件，其功能是進行化學元素的半定量或定量分析。規定X射線能譜儀的檢驗要求和檢驗方法，可完善分析型掃描電鏡綜合測量性能的評價。校準X 射線能譜儀可選用國家標準物質或含量值可溯源的多元素標樣，建議分別在半定量和定量分析兩種使用狀況下對掃描電鏡的譜線分辨力、元素分析范圍、定量分析誤差等技術指標和檢驗方法予以規定。

4 結束語

現有的檢定規程已不適應現代分析型掃描電鏡的計量要求，應抓緊進行修訂。利用專業圖像分析軟件測量原始電子圖像中標樣長度和標尺所包含的像素值，可進行掃描電鏡放大倍數示值誤差、放大倍數重復性以及XY 方向圖像線性失真度的校準，避免了圖像實際放大倍數的計算，提高了測量精度。國家計量技術法規的修訂還應考慮二次電子像分辨力、長度測量誤差以及X 射線能譜儀半定量或定量分析的校準要求。

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