皮質酮濃度對SD大鼠成骨細胞成骨基因表達的影響

康銀輝，魏 波，祝兆波，郭偉雄，王朝軍，宋麗君，林 顥，李廣盛，楚佳奇，曾 榮

(廣東醫學院附屬醫院骨科中心1、生殖中心2，廣東 湛江 524001)

皮質酮濃度對SD大鼠成骨細胞成骨基因表達的影響

康銀輝1，魏 波1，祝兆波1，郭偉雄1，王朝軍1，宋麗君2，林 顥1，李廣盛1，楚佳奇1，曾 榮1

(廣東醫學院附屬醫院骨科中心1、生殖中心2，廣東 湛江 524001)

目的 探討皮質酮對離體SD大鼠成骨細胞功能的影響。方法采用多次膠原酶組織消化法獲得新生SD大鼠顱骨中的成骨細胞作為研究對象，用倒置顯微鏡及堿性磷酸酶、鈣結節染色觀察成骨細胞形態，CCK-8法檢測皮質酮對成骨細胞增殖的影響，根據CCK-8結果將SD大鼠成骨細胞分成四組，分別用含不同濃度的皮質酮(0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L)的DMEM(H)培養基培養，作用24 h后，測定成骨細胞內堿性磷酸酶含量，采用RT-PCR檢測成骨細胞內COL1A、OCN、ALP基因表達，采用Western blot檢測成骨細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達。結果CCK-8結果顯示皮質酮能抑制成骨細胞的增殖，皮質酮能抑制成骨細胞內堿性磷酸酶的生成，與濃度明顯相關；RT-PCR與Western blot檢測可見COL1A、OCN、ALP基因表達及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達下降。結論皮質酮在超生理劑量的濃度下能抑制成骨細胞增殖及細胞內堿性磷酸酶的合成，減少COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達。

皮質酮；成骨細胞；基因表達；成骨

糖皮質激素(Glucocorticoids，GCs)被廣泛用來治療過敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但是，長期、高劑量應用會引起嚴重的并發癥，如骨壞死[1]和骨質疏松癥[2]。由于糖皮質激素良好的臨床療效，很多患者必須長期使用，因此研究糖皮質激素對成骨細胞的影響有重要意義。本文采用體外培養的大鼠顱骨成骨細胞，給予不同濃度的皮質酮，觀察其對成骨細胞增殖、細胞內堿性磷酸酶、成骨功能蛋白及相關基因表達的變化，闡述糖皮質激素對成骨細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 實驗動物：清潔級新生24 h內的SD乳鼠10只，購于廣西醫科大學動物實驗中心。主要試劑：皮質酮(日本梯希愛)，茜素紅S (上海華東試劑公司)，PCR引物(上海生物工程)，蛋白抗體(SANTA CRUZ公司)，CCK-8試劑盒(同仁化學研究所)，堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(南京建成)。

1.2 成骨細胞的提取 新生24 h內SD大鼠胎鼠提取成骨細胞；無菌取下胎鼠顱骨放入無菌PBS中浸泡并剔去骨膜等物質，然后用剪刀將顱骨頭剪成(1×1)mm3大小的組織塊，移至15 ml離心管中，加入5 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，去掉胰蛋白酶后加入含0.2%的Ι型膠原酶的消化液消化，消化6個循環，每次在37℃水浴消化30 min，取第3、4、5、6次消化的細胞懸液，1 300 r離心10 min，棄上清，沉淀的細胞用不含血清的高糖DMEM洗劑離心1次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液重懸吹打均勻后，以1×105/ml接種于培養瓶中，放入5%CO2、37℃的培養箱中培養，24 h后換液，以后每2～3 d換液并在顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長至半匯合鋪滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代。

1.3 成骨細胞的鑒定 成骨細胞形態觀察:每日倒置顯微鏡下觀察細胞生長。將傳到第三代的細胞以2×105個/ml接種到鋪有蓋玻片的六孔板中進行細胞爬片，3～4 d后將蓋玻片撈出進行細胞內堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡下觀察。茜素紅染色：稱取0.1 g茜素紅粉劑溶于100 ml蒸餾水中配成0.1%的茜素紅溶液，將爬片10～14 d后的蓋玻片撈出，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗兩遍，用0.1%的茜素紅溶液染色30 min后蒸餾水沖洗兩遍，封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.4 成骨細胞增殖能力分析 將傳到第三代的細胞以5×104/ml密度接種于96孔板，在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養6 h，使細胞完全貼壁。以0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L、100μmol/L的皮質酮作用24 h后，以CCK-8法測定細胞存活率。

1.5 細胞內堿性磷酸酶含量測定 根據CCK-8的結果將實驗分成四組，分別設0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L四個不同的濃度。將傳到第三代的細胞以5×104/ml密度接種于6 cm培養皿中，待細胞完全貼壁后，棄培養基，再加入皮質酮作用濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L培養液，在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，提取各組細胞總蛋白，蛋白質定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度，再根據堿性磷酸酶(AKP)試劑盒說明測定細胞內堿性磷酸酶含量。

1.6 細胞內COL1A、OCN、ALP基因表達量檢測 以105個/孔的密度將細胞接于6孔板中,加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，再加入皮質酮作用濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L培養液，培養24 h、48 h、72 h后提取總RNA，經過濃度測定、逆轉錄反應后行實時熒光定量PCR反應。COL1A、OCN、ALP和內參β-actin引物序見圖1。反應條件為首先95℃變性30 s；然后按95℃5 s，60℃20 s擴增40個循環。每個組的標本重復三次。在反應的第二階段，在每個循環結束后采集熒光信號強度，60℃～95℃間進行融解曲線分析，以分析反應中引物的特異性。測得的Ct值來計算每個樣本目的基因的相對表達量。

圖1 PCR引物序列(F：正向引物，R：反向引物)

1.7 細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達檢測 采用Westernblot法。提取各組細胞總蛋白，蛋白質定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性5 min。各種一抗以1:1 000稀釋，內參(GAPDH)按1:2 000稀釋，二抗按1:5 000稀釋。

2 結果

2.1 成骨細胞的分離與鑒定 成骨細胞倒置顯微鏡觀察：原代細胞培養1 d后貼壁，細胞呈梭形、多角形，7～10 d單層鋪滿瓶壁。傳代細胞多為梭形(圖2)。堿性磷酸酶(ALP)染色：取第三代細胞做堿性磷酸酶(ALP)染色，呈棕黃色為陽性(圖3)。茜素紅(鈣化結節染色)染色：細胞匯合時均呈多層重疊生長，細胞局部堆集成灶狀，形成鈣結節，染色后鈣結節呈橘紅色(圖4)。

2.2 不同濃度皮質酮對成骨細胞增殖的影響 CCK-8示：高濃度皮質酮對細胞增殖有抑制作用，隨著濃度增加，對細胞增殖抑制明顯增加，地塞米松濃度在0.01～100 μmol/L均可抑制細胞增殖，并呈濃度依賴性(與對照組比較，P＜0.05)，見圖5。

2.3 皮質酮作用后成骨細胞內堿性磷酸酶(ALP)含量測定 成骨細胞內堿性磷酸酶(ALP)含量測定顯示在皮質酮濃度為0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L時，與對照比較，ALP含量呈下降趨勢，呈濃度依賴性(與對照組比較，P＜0.05)，見圖6。

2.4 應用皮質酮后熒光定量PCR測定成骨細胞內COL1A、OCN、ALP基因表達 從測定的結果可以看出當不同的濃度的皮質酮分別作用成骨細胞24 h后，細胞內COL1A、OCN、ALP表達總體呈下降趨勢，其中COL1A、ALP基因表達在皮質酮濃度為10.0μmol/L，比皮質酮濃度為0.1μmol/L、1.0μmol/L稍有升高(與對照組比較，P＜0.05)，見圖7。

圖2 原代細胞鋪滿成骨細胞(40×)

圖3 堿性磷酸酶染色(100×)

圖4 茜素紅S染色(40×)

圖5 皮質酮作用成骨細胞24 h后細胞存活率(與對照組比較，aP＜0.05)

圖6 皮質酮作用成骨細胞24 h后細胞內堿性磷酸酶含量(與對照組比較，aP＜0.05)。

圖7 不同濃度的皮質酮對成骨細胞作用24 h后對細胞內COL1A、OCN、ALP基因表達的影響(與對照組比較，aP＜0.05)

2.5 蛋白免疫印跡檢測成骨細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達量 皮質酮0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L分別作用成骨細胞24 h后，與對照組比較，成骨細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達量均呈下降趨勢，其中COL1A在皮質酮濃度為10.0μmol/L時與對照組比較有明顯差異，OCN、RUNX-2在皮質酮濃度為1.0μmol/L、10.0μmol/L出現明顯差異，三種基因的表達的下降均與皮質酮濃度相關(與對照組比較，P＜0.05)，見圖8。

圖8 蛋白免疫印跡檢測成骨細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達量(與對照組比較，aP＜0.05)

3 討 論

目前糖皮質激素在臨床應用越來越廣泛，相應的其應用并發癥也越來越多，目前，糖皮質激素對機體骨骼系統影響的機制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓栓塞學說、脂肪代謝紊亂學說、骨內高壓學說、二次碰撞學說、遺傳以及基因多態性學說等[3-5]。

Ogoshi等[6]發現地塞米松能誘導成骨細胞的凋亡，這種作用與地塞米松的濃度密切相關。Xu等[7]發現地塞米松作用小鼠4周后，其成骨細胞凋亡增加3倍，28%的皮質骨干骺端骨細胞凋亡。已經有大量研究表明，超生理劑量的糖皮質激素能抑制成骨細胞的骨生成活性，促進破骨細胞的骨吸收活性，最終導致骨量不可逆丟失，形成骨質疏松癥[8-10]。

近來有關的研究表明，糖皮質激素可以通過脂肪細胞來間接的影響成骨細胞的增殖、分化及功能。激素抑制骨髓內骨髓間充值干細胞轉錄因子Cbfa1/ Runx2表達，促使特異性轉錄因子PPARγ的表達，從而促使骨髓間從質干細胞向脂肪細胞分化，抑制其向成骨細胞的分化，導致脂肪細胞數量/成骨細胞數量比例增加[11-12]。

本實驗以SD大鼠原代成骨細胞為研究對象，CCK-8細胞增殖實驗表明，不同濃度皮質酮對成骨細胞的增殖均有抑制作用，并呈濃度依賴性。文獻報告生理劑量的激素(≤10-8mol/L)可以促進成骨細胞的分化，然而超生理劑量的激素降低成骨細胞的活性，抑制成骨細胞的分化[13-15]。因此結合CCK-8試驗本文采用的0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L為超生理劑量用于實驗。

ALP能使局部鈣、磷濃度升高，有助于礦物質化的正常進行，是促進骨間質礦化的重要酶，目前認為ALP活性的高低是反應成骨成熟、功能狀態的一個重要指標，成骨細胞內的COL1A、OCN、RUNX-2均是成骨細胞成骨功能的重要指標。本實驗發現不同濃度皮質酮作用成骨細胞后，細胞內堿性磷酸酶含量、基因、蛋白表達均呈下降趨勢；熒光定量PCR結果顯示不同濃度皮質酮作用成骨細胞后，細胞內的COL1A、OCN基因表達都呈下降趨勢，蛋白免疫印跡檢測顯示成骨細胞內COL1A、OCN、RUNX-2蛋白表達下降，并與皮質酮劑量明顯相關。因此，皮質酮能抑制成骨細胞內堿性磷酸酶量、COL1A、OCN、ALP基因及COL1A、OCN、RUNX-2蛋白的表達。

本文結果提示皮質酮在超生理劑量濃度時能抑制上述指標，對成骨細胞成骨活性起著抑制效應。本實驗的不足之處在于僅做了細胞實驗，還需進一步體內實驗驗證。

[1] Liu H,Yang X,Zhang Y,et al.Fullerol antagonizes dexamethasone-induced oxidative stress and adipogenesis while enhancing osteogenesis in a cloned bone marrow mesenchymal stem cell[J]. Journal of Orthopaedic Research,2012,30(7):1051-1057.

[2]Duyvendak M,Naunton M,van Roon EN,et al.Doctors’beliefs and knowledge on corticosteroid-induced osteoporosis:identifying barriers to improve prevention[J].Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics,2011,36(3):356-366.

[3]Mont MA,Jones LC,Hungerford DS.Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head:ten years later[J].The Journal of Bone&Joint Surgery,2006,88(5):1117-1132.

[4]McGrory BJ,York SC,Iorio R,et al.Current practices of AAHKS members in the treatment of adult osteonecrosis of the femoral head [J].The Journal of Bone&Joint Surgery,2007,89(6):1194-1204.

[5]Lieberman JR,Berry DJ,Mont MA,et al.Osteonecrosis of the hip: management in the 21st century[J].Instructional Course Lectures, 2002,52:337-355.

[6]Ogoshi T,Hagino H,Fukata S,et al.Influence of glucocorticoid on bone in 3-,6-,and 12-month-old rats as determined by bone mass and histomorphometry[J].Modern Rheumatology,2008,18(6): 552-561.

[7]Xu J,Liu X,Chen J,et al.Simvastatin enhances bone marrow stromal cell differentiation into endothelial cells via notch signaling pathway[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2009,296(3):535-543.

[8]Maricic M.Update on glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Rheumatic Disease Clinics of NorthAmerica,2011,37(3):415-431.

[9]Hoeppner LH,Secreto FJ,Westendorf JJ.Wnt signaling as a therapeutic target for bone diseases[J].Expert Opin Ther Targets,2009, 13(4):485-496.

[10]Bonewald LF,Johnson ML.Osteocytes,mechanosensing and Wnt signaling[J].Bone,2008,42(4):606-615.

[11]Ren D,Collingwood TN,Rebar EJ,et al.PPARγknockdown by engineered transcription factors:exogenous PPARγ2 but not PPARγ1 reactivates adipogenesis[J].Genes&Development,2002,16(1):27-32.

[12]Li X,Jin L,Cui Q,et al.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression[J].Osteoporosis International, 2005,16(1):101-108.

[13]Rauch A,Seitz S,Baschant U,et al.Glucocorticoids suppress bone formation by attenuating osteoblast differentiation via the monomeric glucocorticoid receptor[J].Cell Metabolism,2010,11(6):517-531.

[14]Kitase Y,Barragan L,Qing H,et al.Mechanical induction of PGE2 in osteocytes blocks glucocorticoid-induced apoptosis through both theβ-catenin and PKA pathways[J].Journal of Bone and Mineral Research.2010,25(12):2657-2668.

[15]Xia X,Kar R,Gluhak-Heinrich J,et al.Glucocorticoid-induced autophagy in osteocytes[J].J Bone Miner Res,2010,25(11):2479-2488.

Effect of corticosterone concentration on osteoblastic gene expression of SD rat osteoblasts.

KANG Yin-hui1,WEI Bo1,ZHU Zhao-bo1,GUO Wei-xiong1,WANG Chao-jun1,SONG Li-jun2,LIN Hao1,LI Guang-sheng1,CHU Jia-qi1, ZENG Rong1.Orthopedic Centre1,Lab of Reproductive Medicine2,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different corticosterone concentration on the gene expression of SD rat osteoblastsin vitro.MethodsNewborn SD rat osteoblasts in the skull were obtained by many times of collagenase digestion as the object of study.The osteoblastic morphology was observed using inverted microscope,alkaline phosphatase and calcium nodes dyeing.And the effect of corticosterone concentration on osteoblastic proliferation was detected by CCK-8.According to the scores of CCK-8,the SD rat osteoblasts were divided into four groups with different corticosterone concentrations of DMEM(H)culture(0 μmol/L,0.1 μmol/L,1.0 μmol/L,10.0 μmol/L). After 24 hours of DMEM(H)culture,content of osteoblastic alkaline phosphatase were measured,gene expressions of osteoblastic COL1A,OCN,ALP were detected by RT-PCR,and the protein expression of osteoblastic COL1A, OCN,RUNX-2 were measured by western blot.ResultsThe scores of CCK-8 showed that corticosterone can restrain the proliferation of SD rat osteoblasts and the formation of osteoblastic alkaline phosphatase,which were significantly related to concentration.And the results of RT-PCR and western blot both showed decreased expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.ConclusionCorticosterone beyond physical dosage can inhibit the proliferation of osteoblasts and synthesis of intracellular alkaline phosphatase,and reduce the expression of COL1A,OCN,ALP gene and COL1A,OCN,RUNX-2 protein.

Corticosterone;Osteoblasts;Gene expression;Osteogenesis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2661—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0969

2015-05-12)

廣東省科技計劃項目（編號：2011B031800172）

魏 波。E-mail：webjxmc@163.com