烤煙中性致香物質在烘烤前后的差異分析

趙會納，蔡 凱，雷 波*，武圣江，任 竹，向章敏，潘文杰，姚珊珊，蔡 斌

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.重慶市煙草公司黔江分公司，重慶409000）

烤煙中性致香物質在烘烤前后的差異分析

趙會納1，蔡 凱1，雷 波1*，武圣江1，任 竹1，向章敏1，潘文杰1，姚珊珊2，蔡 斌1

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.重慶市煙草公司黔江分公司，重慶409000）

為探求烘烤過程對烤煙中性致香物質的影響，采用頂空固相微萃取-全二維飛行時間質譜聯用法和半葉法研究了K326和南江3號煙葉中性致香物質種類、含量及其比例在烘烤前后的差異。結果表明：（1）多種香氣物質在烘烤過程中發生了轉化，有19種香氣物質在烤后煙葉未檢測到，但增加了36種香氣物質。（2）烘烤后香氣物質總量顯著增加，且不同品種烤煙香氣物質轉化程度不同，K326的香氣物質總量（不含新植二烯）顯著高于南江3號。（3）烘烤后西柏烷類降解產物占中性致香物質總量的比例明顯降低，而苯丙氨酸降解產物和類胡蘿卜素降解產物所占比例明顯提高。在烘烤過程中損失了醛、醇和酯類等19種香氣物質，產生了類胡蘿卜素降解產物、棕色化反應產物等36種香氣物質。

烤煙；頂空固相微萃取-全二維飛行時間質譜聯用法；烘烤；品種；中性致香物質

香氣物質的組成和含量是衡量煙葉品質的重要指標之一，也是衡量煙葉內在品質和香氣狀況最直接、可靠的指標［1］。調制過程是煙葉香氣前體物降解，香氣形成和轉化的主要時期［2-4］，在調制期間，伴隨著香氣前體物的降解及一系列復雜的生理生化反應，許多揮發性致香成分產生或含量增加，但也有一些成分保持穩定或減少甚至消失［5-8］。而目前特色煙葉重大專項研究中物質代謝基礎研究主要采用大田鮮煙葉，而化學特征物質以及評價定位研究采用烤后煙葉，研究中使用的煙葉樣品狀態不同導致研究結果可能脫節，本試驗研究烘烤前后煙葉中物質轉化及其變化規律，可將三者研究結果有機的結合起來，為解析香型形成的物質代謝途徑提供了依據。在致香物質的研究中應用較多的方法有同時蒸溜萃取法（SDE）［9］、溶劑萃取法［10］、頂空共蒸餾法（HCD）［11］和加速溶劑萃取法（ASE）［12］，這些方法操作不僅耗時、且萃取時容易造成部分揮發性香氣成分損失或分解變化。而固相微萃取（SPME）是近年來出現的一種新的采樣技術，具有操作簡便、測定快速、樣品用量少、無需溶劑等優點。王璐等［13］采用固相萃取-氣質聯用的方法分析了煙葉中的致香物質，證實了SPME是一種快速準確分析煙葉中致香物質的方法，而全二維氣相色譜（GC×GC）及其與飛行時間質譜（TOFMS）聯用是新近發展起來的適合用于復雜體系分析的一種高分辨、高靈敏度的分離鑒定技術［14］。因此本研究采用頂空固相微萃取-全二維飛行時間質譜聯用法比較了烘烤前后中性致香物質種類、含量及比例的差異，以期為研究香氣物質的前體物及其在烤煙生長過程中的代謝基礎以及調控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2013年在貴州省煙草科學研究院福泉基地進行，供試品種為貴州省主栽品種K326和南江3號。在煙株中部葉成熟采烤前，以第12葉位（從下往上數）為取樣對象，采用半葉法將葉片從主脈分開，一半立即液氮冷凍，并采用真空冷凍法干燥；另一半正常烘烤（含主脈）。每個品種取3個重復，每個重復8片。為避免水分含量差異，將烘烤后的煙葉樣品去主脈，置40℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，將煙葉粉碎后過60目篩后低溫密封保存備用。

采用散葉密集烘烤的方式進行烘烤，將2個品種烤煙裝在同一烤房內相同或相對的位置，放置在烤房第二層（從頂層起），烤房裝煙平均密度為75 kg/m3，根據煙葉變化調控烘烤工藝［15］。

1.2 測定方法

1.2.1 真空冷凍干燥方法（1）樣品預凍：將煙葉樣品在冷凍干燥儀中-20 ℃保持5h；（2）第一階段升華：在0 ℃下干燥15h；（3）第二階段升華：在20 ℃下干燥直至樣品恒重。將煙葉粉碎后過60目篩后低溫密封保存備用。

1.2.2 致香物質測定方法基于動態頂空采用全二維氣相色譜飛行時間質譜（GC×GC-TOFMS）測定中性致香物質含量［16］，在貴州省煙草科學研究院分析檢測研究中心測定。

1.3 數據分析

采用SPSS16.0軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 烘烤前后中性致香物質種類差異

烤煙煙葉中性致香物質種類在烘烤前后發生了顯著的變化，其中有19種香氣物質僅在烘烤前煙葉中檢測到，有36種香氣物質僅在烘烤后煙葉中檢測到，另外還有23種香氣物質在烘烤前后煙葉中均檢測到。

2.1.1 烘烤前獨有的致香物質從表1可知，僅在烘烤前煙葉中檢測到的19種致香物質主要是一些醛、醇和酯類物質，這些物質在烤后煙葉中未檢出，推測烘烤過程中溫度和水分的劇烈變化造成了這19種致香物質的轉化或損失。在品種間表現為：南江3號有11種致香物質（苯乙醛等）含量極顯著高于K326，己醛含量顯著高于K326，但N-氧化-2，2'-聯吡啶極顯著低于K326。

2.1.2 烘烤前后共有的致香物質差異從表2可知，2個烤煙品種的致香物質含量在烘烤前后有顯著變化，其中K326煙葉的6種致香物質含量（2-乙酰吡咯、苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇、二氫獼猴桃內酯、新植二烯）在烘烤后呈極顯著增加，4種類胡蘿卜素降解產物含量（β-紫羅蘭酮、芳樟醇、松油醇、香葉基丙酮）呈顯著增加，而1，1'-二甲基-2，2'-聯二吡咯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和降茄二酮在烘烤后呈極顯著下降，2，6-二甲基-2，6-辛二烯和壬醛呈顯著下降。南江3號的β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、香葉基丙酮、新植二烯和十一醛5種致香物質在烘烤后呈極顯著增加，3種棕色化反應產物2-丁基噻吩、2-乙酰吡咯和六氫化-8a-甲基-1，8-（2H，5H）-萘二酮呈顯著增加，而6-甲基-5-庚烯-2-酮、藏紅花醛、降茄二酮、茄酮、2，6-二甲基-2，6-辛二烯呈極顯著降低。總體來看，K326和南江3號煙葉中2-乙酰吡咯、苯乙醇、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、香葉基丙酮、十一醛和新植二烯含量在烘烤后呈極顯著或顯著增加，而6-甲基-5-庚烯-2-酮、降茄二酮和2，6-二甲基-2，6-辛二烯含量在烘烤后呈極顯著或顯著降低。

2.1.3 烘烤后獨有致香物質僅在烘烤后煙葉中檢測到的36種致香物質主要是類胡蘿卜素降解產物、棕色化反應產物和其他類香氣物質，這些物質在烘烤前煙葉中未檢出，推測其均屬于烘烤過程中產生的次生代謝產物。由表3可知，在品種間表現為：K326有31種香氣物質含量不同程度的高于南江3號，其中β-二氫大馬酮和巨豆三烯酮D含量極顯著高于南江3號，其含量分別是南江3號的2.61倍和2.84倍，3-羥基-α-二氫大馬酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮C和巨豆三烯酮E含量顯著高于南江3號，其含量分別是南江3號的1.60倍、2.07倍、2.14倍、2.04倍、2.18倍和2.35倍。

表1 不同烤煙品種烘烤前獨有致香物質含量 ng/gTable1 The aroma components only found intobacco leaves before curing

表2 不同烤煙品種烘烤前后共有致香物質含量 ng/gTable2 The common aroma components contents in two tobacco cultivars before and after curing

表3 烘烤后獨有中性致香物質含量ng/gTable3 The aroma components only found in tobacco leaves after curing

2.2 烘烤前后中性致香物質比例差異

從表4可知，新植二烯含量最高，占致香物質總量的77.92%～85.79%，因此將其單獨分析。2個品種4類香氣物質在烘烤前后所占比例（除美拉德反應產物）變化趨勢相同，其中西柏烷類降解產物和其他類香氣物質總量所占比例下降，K326降幅分別為11.26%和31.39%；南江3號降幅分別為6.17%和76.70%；而苯丙氨酸降解產物和類胡蘿卜素降解產物所占比例明顯上升，K326升幅為522.57%和800.00%，南江3號升幅為59.79%和468.82%。

表4 烘烤前后中性致香物質比例差異 %Table4 The differences of proportion of the neutral aroma compounds in two flue-cured tobacco leaves before and after curing

3 討論

在已有的關于烤煙香氣物質研究中，大多數集中在生態條件、遺傳因素、栽培措施、烘烤工藝等對香氣物質的影響，而關于烘烤前后香氣物質的轉化研究較少。王嵐等［7］采用同時蒸餾萃取結合GC-MS法研究了K326煙葉在烘烤過程中致香成分變化，發現鮮煙葉中的葉醇（3-己烯醇）、3-己烯醛、2-己烯、6-甲基-5-乙基-3-庚烯-2-酮、己醇和己醛在烤后煙中不再檢出，苯丙氨酸降解產物（苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇）、新植二烯以及一些類胡蘿卜素類降解產物（二氫獼猴桃內酯、β-紫羅蘭酮、芳樟醇、松油醇、香葉基丙酮）含量在烘烤后顯著增加，在烤后煙檢測到了一些新增的香氣物質如糠醇、愈創木酚、氧代-α-紫羅蘭醇，這些結果與本研究相同，但在鮮煙葉中檢出的一些成分（如3-羥基-α-二氫大馬酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、巨豆三烯酮、異佛爾酮、糠醛）及在烘烤后損失的一些香氣成分（如2-戊基呋喃、2，2二氫-2，2-甲基呋喃、苯并噻唑）在本試驗鮮煙葉中均未被檢測到，究其原因可能有兩點，一是煙葉產地不同，不同產地因光照、溫度等條件的不同影響類胡蘿卜素的積累［17］，另外有研究也表明不同生態區煙葉的致香物質存在一定的差異［18］；二是測定方法不同，本試驗采用頂空固相微萃取直接在60 ℃下頂空進樣，無需溶劑處理，同時所用煙葉是冷凍干燥后的煙葉，在無水分無溶劑的條件下萃取能保證煙葉原有的風格特征［16，19］，而該研究是鮮煙葉在沸食鹽水中蒸餾，可能產生一些副產物并造成煙葉內部揮發性香氣成分損失或分解變化，該研究在鮮煙葉中檢測到的2-戊基呋喃、2，2二氫-2，2-甲基呋喃、苯并噻唑等美拉德反應物質，可能是鮮煙葉在沸水中蒸餾時發生糖和氨基酸反應的非酶促氧化性褐變產生的，3-羥基-α-二氫大馬酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、巨豆三烯酮、異佛爾酮等物質可能是鮮煙葉蒸餾時類胡蘿卜素物質的降解轉化產生的，因為類胡蘿卜素物質本身含有較多的共軛雙鍵，對熱、光、氧等因素比較敏感，容易降解和異構化，如β-胡蘿卜素在脂氧合酶作用下可形成β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內酯等，葉黃素發生雙鍵斷裂可生成3-羥基-α-紫羅蘭酮和氧化異佛爾酮，3-羥基-α-紫羅蘭酮可進一步轉化形成巨豆三烯酮［20］。

近年來，關于煙葉特色形成的物質代謝機理研究已逐漸成為烤煙研究熱點之一。很多學者對不同香型生態區初烤煙葉香氣物質進行了分析，如席元肖等［21］采用同時蒸餾萃取法結合GC-MS法對初烤煙葉（B2F和C3F）香氣物質進行研究，發現中間香型煙葉β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯和芳樟醇含量顯著低于清香型，巨豆三烯酮4種同分異構體的含量極顯著低于濃香型。詹軍等［22］也采用同時蒸餾萃取法結合GC-MS法分析比較了C3F煙葉中類胡蘿卜素降解香氣物質差異，結果表明，不同香型烤煙的類胡蘿卜素降解形成的各種香氣物質含量存在較大差異。前人的研究表明，初烤煙葉中類胡蘿卜素降解產物與煙葉特色有一定的相關性。通過對不同香型煙葉轉錄譜和次生代謝物質研究發現，類胡蘿卜素物質在鮮煙葉中含量與煙葉特色相關［23］。本試驗發現烘烤過程中造成了54種致香物質的轉化，其中包括類胡蘿卜素物質降解產生了如巨豆三烯酮A、B、C、D、E、β-大馬酮、β-二氫大馬酮和β-紫羅蘭醇等18種香氣物質。綜上，不同香型煙葉烘烤前類胡蘿卜素物質累積不同，導致烘烤后降解產物含量不同。因此，研究煙葉烘烤前后物質變化，有利于研究烤后煙葉中重要化學物質如香氣類物質等的前體物，為下一步研究這些物質在烤煙生長過程中的代謝基礎以及調控提供依據。

本試驗結果表明，在烘烤過程中發生了多種物質的轉化，損失了醛、醇和酯類等19種香氣物質，產生了類胡蘿卜素降解產物、棕色化反應產物等36種香氣物質。

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Difference of the Neutral Aroma Compounds in Flue-cured Tobacco before and after Curing

ZHAO Huina1， CAI Kai1， LEI Bo1*， WU Shengjiang1， REN Zhu1， XIANG Zhangmin1，PAN Wenjie1， YAO Shanshan2， CAI Bin1
（1.Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China；2. Qianjiang Tobacco Company of Chongqing， Chongqing 409000， China）

In order to study the effect of curing process on neutral aroma compounds of tobacco， HS-SPME-GC×GC-TOFMS and half leaf method were used to analyze kinds， contents and proportion of the neutral aroma compounds in two flue-cured tobacco cultivars （K326， Nanjiang 3） before and after curing. The results showed that there were significant changes in kinds， contents and proportion of the neutral aroma compounds. （1） Many kinds of aroma compounds were degraded or transformed during curing process， 19 aroma compounds uniquely found in tobacco leaves before curing and 36 extra aroma compounds found in tobacco leaves after curing； （2） By the end of curing， the total amount of aroma compounds were significantly higher than before curing， and the total amount of aroma compounds （except neophytadiene） in K326 was significantly higher than that Nanjiang 3 for witch transformed more fully；（3） The proportion of phenylalanine degradation products and carotenoids degradation products in the total amount of neutral aroma compounds increased significantly. Conversely， the proportion of cembratriendid compounds significantly decreasedafter curing. In conclusion， 36 kinds of extra aroma compounds （mainlymaillard reaction production and carotenoid degradation production） generated during cuing， but 19 kinds ofaromatic components （mainlyaldehydes，alcohols and esters） lost.

flue-cured tobacco； HS-SPME-GC×GC-TOFMS； curing； cultivar； neutral aroma compound

TS41+1

1007-5119（2015）02-0008-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.002

國家煙草專賣局重大專項“中間香型特色優質煙葉開發物質代謝基礎研究”（TS-02-20110014）；貴州省煙草公司項目（201315）

趙會納，女，碩士，助理研究員，從事煙草栽培生理和物質代謝研究。E-mail： zhaohn1983@163.com。*通信作者，E-mail： leibo_1981@163.com

2014-07-03

2014-09-20