鹽霉素抗癌細胞及癌干細胞作用的研究進展

許 寧，歐仁杰，王曉慶，張會朋，石愛平

（1.吉林大學第一醫院泌尿外科，吉林 長春 130021；2.玲瓏英誠醫院外科，山東 招遠 265400；3.吉林大學第一醫院普外科，吉林 長春 130021）

鹽霉素 （salinomycin）是上世紀70年代初宮崎等［1］從白色鏈霉菌 （菌株號：No.80614）中提取的1元羧酸聚醚類小分子化合物，同時也是具有生物活性的新型抗生素。其分子式為C42H70O11，分子表面具有親脂性，內部包含氧原子和1個羧基的離子載體［2］。鹽霉素對細胞中的陽離子，尤其K＋和Na＋的親和力特別強，使生物所必需的陽離子通過膜上脂質屏障的浸透性增強，阻礙細胞內外陽離子的傳遞，導致細胞內外離子濃度發生變化［3］。這些生物學特性使鹽霉素對革蘭陽性菌、部分絲狀真菌、瘧原蟲及引起家禽疾病的球蟲類生物有抑制作用，被用于防治家禽的球蟲病和提高反芻動物的飼料吸收率。2009年，Gupta等［4］首次在 《Cell》雜志上發表了鹽霉素能夠選擇性殺死乳腺癌干細胞的文章，這一發現具有較為深遠的意義。在此基礎上，研究者［5－16］用鹽霉素與多種不同的癌細胞及癌干細胞進行研究，結果均表明鹽霉素能夠抑制多種癌細胞及癌干細胞的生長及轉移，并誘導其凋亡。

1 鹽霉素抗癌細胞及癌干細胞的作用機制

近年來，通過鹽霉素對多種癌細胞及癌干細胞體外及體內實驗研究［5－16］發現：鹽霉素對癌細胞及癌干細胞的抑制作用主要通過以下幾種機制來實現：①抑制 Wnt／β－catenin信號途徑。目前的研究認為 Wnt／β－catenin信號途徑在癌干細胞發生發展中具有重要作用，而鹽霉素是通過對 Wnt／β－catenin信號途徑中相關蛋白及 Wnt／β－catenin信號途徑的靶基因及蛋白表達抑制來實現對癌細胞及癌干細胞增殖及轉移的抑制作用；②誘導癌細胞及癌干細胞中凋亡蛋白表達增加，克服癌細胞及癌干細胞的凋亡抵抗作用，促進細胞凋亡；③誘導癌細胞及癌干細胞氧化應激反應，增加細胞中的活性氧 （ROS）水平，從而誘導細胞凋亡。

2 鹽霉素抗癌作用及相關機制

2.1 鹽霉素與乳腺癌 2009年，Gupta等［4］發現鹽霉素能夠選擇性殺傷乳腺癌HMLEshEcad細胞株中CD44high／CD24low細胞，經鹽霉素處理后HMLEshEcad細胞株中CD44high／CD24low細胞數量為紫杉醇對照組細胞數量的1／360；應用基因組富集分析法檢測分析鹽霉素作用后的乳腺癌細胞中侵襲性基因組，發現CD44／CD24基因組和乳腺微球基因組表達水平降低。在裸鼠體內實驗中，鹽霉素作用組較紫杉醇作用組乳腺癌干細胞成瘤及轉移能力降低100多倍。Bj?rklund等［5］和 Liu等［6］認為：LRP5和 LRP6受體是 Wnt／β－catenin信號途徑中的致瘤蛋白，在以 Wnt／β－catenin信號途徑為主發生的腫瘤中具有重要作用。異常表達的LRP5剪接異構體被發現與乳腺癌的形成有關，同時，LRP6亦被發現在乳腺惡性腫瘤中的表達異常增高。異常增高表達的LRP6能夠導致小鼠乳腺增生，下調LRP6則能夠降低乳腺癌的發生率，同時糖原合成酶激酶3、酪蛋白激酶1γ等則在LRP6的磷酸化中發揮重要作用。Zhang等［7］在對鹽霉素與乳腺癌的體內與體外研究中發現：鹽霉素與紫杉醇聯合應用可以更有效地治療乳腺癌。三陰乳腺癌預后較差，2012年King等［8］的研究發現：三陰乳腺癌預后較差主要是由于乳腺癌細胞中存在乳腺癌干細胞。近年來的研究［4－8］表明：Wnt／β－catenin途徑在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用，而鹽霉素已經被證實是 Wnt／β－catenin途徑抑制劑，鹽霉素對Wnt／β－catenin途徑的抑制作用在對乳腺癌及癌干細胞的抑制作用中可能發揮關鍵作用。

2.2 鹽霉素與胃癌 Zhi等［9］在對鹽霉素與胃癌細胞的體外實驗研究中發現：首先檢測胃癌細胞株 NCI－N87、SNU－1、SGC－7901 和 BGC－823 細 胞 表 面 ALDH、Sox2、Nanog和Nestin干細胞分子標志物，證明了NCI－N87和SNU－1細胞株為 ALDH 高表達，SGC－7901和BGC－823為ALDH低表達。然后通過細胞集落實驗及懸浮球實驗證明高表達ALDH的細胞比低表達ALDH的細胞克隆形成能力及成球能力強，干細胞特性更明顯。最后將ALDH高表達和低表達的胃癌細胞分組，分別加入5－Fu、CDDP和鹽霉素進行藥物抵抗實驗，結果表明：高表達ALDH的胃癌細胞在傳統化療藥物5－Fu和CDDP中存活及成球率較高，但對鹽霉素較為敏感，存活及成球率較低，而且鹽霉素對ALDH高表達胃癌細胞抑制作用效果是ALDH低表達胃癌細胞的4倍，提示鹽霉素對耐藥作用較強的胃癌干細胞抑制作用明顯。Zhi等［9］研究證明了鹽霉素對胃癌干細胞的抑制作用，并對胃癌敏感化療藥物的選擇具有重要指導作用。Mao等［10］在對胃癌干細胞的研究中發現：Wnt／β－catenin信號途徑能夠促進胃癌干細胞在體內及體外的增殖，并在癌干細胞的自我更新中可能發揮重要作用；通過抑制 Wnt／β－catenin信號途徑能夠抑制胃癌干細胞的增殖。

2.3 鹽霉素與結直腸癌 Dong等［11］認為：結直腸癌治療及預后效果較差是因為存在癌干細胞，并進行體外實驗以證明其觀點。實驗選取結直腸癌HT29和SW480細胞株，這2種細胞表面分別高表達及中等程度表達CD133＋，具有結直腸癌干細胞特性。實驗利用CCK－8試劑盒檢測鹽霉素作用后的癌干細胞活力，結果提示2種干細胞活力均下降；流式細胞術檢測發現CD133＋細胞亞種群所占比例減少；軟瓊脂和Boyden分析顯示2種癌干細胞克隆形成和遷移能力降低；利用免疫熒光染色、RT－PCR及蛋白印跡實驗檢測分子學變化，結果表明：鹽霉素促進了HT29和SW480細胞株凋亡，減少了CD133＋細胞亞種群所占比例，降低了HT29和SW480細胞克隆形成能力及細胞活性，增加了E－鈣黏蛋白相關基因及蛋白表達量。現已證實E－鈣黏蛋白表達增加能抑制上皮間質轉化 （MET），而這種轉變能使上皮癌細胞表現出癌干細胞的特性及侵襲性。因此Dong等通過體外實驗證明了鹽霉素能夠降低結直腸癌干細胞MET，推斷鹽霉素可能是抑制結直腸癌干細胞潛在的有效藥物。

2.4 鹽霉素與前列腺癌 2011年Kim等［12］對鹽霉素與前列腺癌進行了體外實驗研究，結果顯示：鹽霉素作用后的前列腺癌細胞活性明顯降低，而正常前列腺細胞活性不受影響。進一步研究發現：鹽霉素作用后的前列腺癌細胞中逃避細胞凋亡程序相關蛋白Bcl－2水平降低，促凋亡蛋白Bax水平升高，PARP－1裂解，凋亡酶caspase－3被激活，同時發現前列腺癌細胞中ROS水平明顯增加，而ROS水平的增加可以通過多種途徑來誘發細胞的凋亡。Ketola等［13］則通過體外實驗進一步研究了鹽霉素與前列腺癌及癌干細胞的關系，結果顯示：鹽霉素能夠抑制由VCaP和LNCa細胞中分離出的前列腺癌干細胞中ALDH－1及CD44的表達，并且降低VCaP和LNCa細胞中干細胞比例，實驗結果表明：鹽霉素不僅能促進前列腺癌細胞的凋亡，還能抑制前列腺癌干細胞的增殖。

2.5 鹽霉素與胰腺癌 Lei等［14］在鹽霉素與胰腺癌的體外研究中發現：鹽霉素作用后癌細胞中CD133＋細胞亞群比例減少，同時檢測到促凋亡蛋白Bax和E黏鈣蛋白的表達量明顯上調，且能夠使細胞異常增殖的Bcl－2和PCNA的表達量明顯降低；Wnt／β－catenin途徑中相關蛋白β－catenin和p－GSK－3β的表達受到抑制。研究者推測鹽霉素對胰腺癌的抑制作用可能與 Wnt／β－catenin途徑有極為密切的關系。Zhang等［15］則采取聯合藥物實驗檢測鹽霉素對胰腺癌細胞及癌干細胞的作用。研究者首先利用熒光激活細胞分選技術 （FACS）從 SW1990和 AsPC－1細 胞 株 中 分 選 出CD133＋細胞、CD133－細胞、SP細胞和NSP細胞，并采用鹽霉素和吉西他濱分別作用于CD133＋細胞、CD133－細胞、SP細胞和NSP細胞，通過MTT比色法檢測鹽霉素和吉西他濱對上述細胞的毒性作用，結果顯示：鹽霉素對CD133＋細胞和SP細胞的毒性作用明顯強于對CD133－細胞的毒性作用，而吉西他濱則顯示出對CD133－細胞及NSP細胞較強的毒性作用，提示鹽霉素能更有效地殺傷胰腺癌干細胞及具有干細胞特性的SP細胞而吉西他濱則無此效果。在聯合鹽霉素及吉西他濱作用于CD133＋細胞、CD133－細胞、SP細胞和NSP細胞實驗中，通過MTT比色法檢測2種藥物聯合后對癌細胞及癌干細胞的毒性作用，結果顯示：鹽霉素和吉西他濱聯合作用能有效地殺傷CD133＋細胞、CD133－細胞、SP細胞和NSP細胞，并且作用效果明顯優于單一藥物使用。最后研究者通過裸鼠體內實驗發現：鹽霉素和吉西他濱聯合應用比單一使用鹽霉素或吉西他濱能夠更有效地抑制裸鼠體內腫瘤的生長。Lei等［14］和Zhang等［15］的研究發現：鹽霉素對胰腺癌細胞及癌干細胞具有抑制作用，且聯合吉西他濱作用效果更為明顯，這為胰腺癌治療提供了一個新的思路，可能會取得較為理想的效果。

2.6 鹽霉素與肝癌 Wang等［16］采用鹽霉素與肝癌細胞株（HepG2，SMMC－7721，BEL－7402）進行研究。在體外實驗中肝癌細胞增殖降低、凋亡增加，CD133＋的干細胞亞群比例減少；Bcl－2、GSK－3β和β－catenin相關基因和蛋白的表達量減少。體內實驗結果顯示：裸鼠肝臟腫瘤中的肝小葉結構遭到破壞；鹽霉素實驗組細胞凋亡率高于對照組，且治療組較對照組 Bax／Bcl－2比值升高，p－GSK－3β表達降低但是GSK－3β總量不變，β－catenin相關蛋白表達減少。體內體外實驗結果均表明：鹽霉素能夠明顯促進肝癌細胞的凋亡且抑制增殖。研究者［17－18］認為：這與Bcl－2家族基因表達下降和Bax表達增加有關。Bcl－2家族在癌細胞逃避細胞凋亡程序中發揮重要作用，而Bax則能促進細胞凋亡。研究者［16］還發現鹽霉素作用后的肝癌細胞中 Gsk－3β使β－catenin表達量下降。已有多篇文獻［19－20］證明：Wnt／β－catenin途徑中β－catenin蛋白的表達與肝癌細胞的凋亡關系密切。Wang等［16］在應用流式細胞術對肝癌細胞中CD133＋細胞亞群分析中發現：CD133＋細胞亞群比例降低。而肝癌細胞中CD133＋細胞具有癌干細胞特性［21－23］。這些研究表明：鹽霉素不僅對肝癌細胞具有抑制作用，且對肝癌干細胞也有抑制作用。

2.7 鹽霉素與卵巢癌 Parajuli等［24］采用鹽霉素與卵巢癌細胞株 （A2780和A2780cis）進行的體外實驗研究中首次提出并證明了鹽霉素能夠抑制卵巢癌Akt／NF－kB途徑并導致癌細胞的凋亡增加，實驗發現：鹽霉素能夠抑制卵巢癌細胞中Akt蛋白激酶，使NF－κB的表達降低，從而導致了細胞凋亡。為了證明Akt在細胞凋亡中作用，Parajuli等［24］采用siRNA轉染以靜默Akt相關基因，同樣使卵巢癌細胞凋亡增加。在細胞周期分析中發現：鹽霉素能夠使亞G 1期卵巢癌細胞比例增高，而成熟卵巢癌細胞比例降低。卵巢癌細胞株A2780cis能夠抵抗順鉑類藥物，Parajuli等［24］的實驗發現：鹽霉素作用后A2780cis細胞凋亡增加，提示其對順鉑藥物耐藥的卵巢癌細胞具有較好的殺傷效果。Zhang等［25］進行卵巢癌細胞OV2008的體內和體外實驗研究，提出鹽霉素是通過調節P38MAPK以實現促進細胞凋亡的作用。這提示鹽霉素對卵巢癌的抑制作用可能是通過多種途徑實現的。

2.8 鹽霉素與肺癌 Arafat等［26］在非小細胞肺癌細胞LNM35和A549細胞株的體外研究中發現：鹽霉素能夠抑制并促進其凋亡，并且具有時間－劑量相關性。肺癌具有較高的遠處轉移及局部浸潤性，肺癌的治療及預后效果極差。而Arafat等［26］在研究中發現：鹽霉素可以促進NAG－1 mRNA及NAG－1蛋白的表達，使LNM35和A549細胞株的侵襲及轉移能力降低，并且這種作用與NAG－1蛋白的水平呈正相關關系。為了證明鹽霉素對癌細胞轉移及侵襲能力的作用是通過NAG－1蛋白來實現的，研究者構建了NAG－1基因靜默細胞，使NAG－1蛋白不能表達，然后采用5μmol·L－1鹽霉素處理，結果顯示：鹽霉素不能抑制癌細胞的侵襲作用，甚至會出現反作用。Wang等［27］進行的A549細胞株體外實驗證明：鹽霉素能夠明顯減少肺癌細胞的成球率，并能降低Oct－4、胚胎干細胞關鍵蛋白Nanog及Sox2水平，表明鹽霉素能夠抑制肺癌干細胞生長。曾葭等［28］在鹽霉素與耐順鉑肺癌細胞株A549／DDP體外實驗中，通過流式細胞術檢測鹽霉素作用后的A549／DDP細胞株，結果顯示：線粒體膜電位下降、細胞色素C和Ca＋釋放增加，細胞中ROS水平增加；同時Bcl－2／Bax比值顯著降低，且β－catenin和LRP6蛋白表達降低。表明鹽霉素不僅可以通過誘導細胞內氧化應激增加實現對耐順鉑肺癌A549／DDP細胞株的促凋亡作用，同時可以通過抑制 Wnt途徑以實現對耐順鉑肺癌A549／DDP細胞株的生長抑制作用。這些研究成果提示：鹽霉素可能成為一個很有前途的肺癌化療藥物，為臨床肺癌治療提供新的方案。

2.9 鹽霉素與膀胱癌 Ou等［29］對鹽霉素與人膀胱癌5637細胞進行了體外實驗研究，采用MTT比色法發現鹽霉素作用后膀胱癌細胞存活率顯著降低；應用流式細胞技術發現鹽霉素作用后膀胱癌5637細胞凋亡率升高；通過體外Matrigel實驗顯示膀胱癌5637細胞的轉移及侵襲能力降低；通過蛋白印跡實驗顯示Wnt／β－catenin途徑中關鍵蛋白β－catenin表達量下降，結果證明：鹽霉素對人膀胱癌5637細胞的生長有較明顯抑制作用，能促進癌細胞凋亡，降低癌細胞侵襲力，并且這種抑制作用可能是通過抑制Wnt／β－catenin信號傳導途徑實現的。這些實驗結果為膀胱癌的治療提供了新思路。

2.10 鹽霉素與白血病 2011年Lu等［30］在鹽霉素與慢性淋巴細胞白血病體外研究中發現：鹽霉素能夠促進HEK293細胞凋亡，鹽霉素能夠通過結合Wnt1使脂蛋白受體相關蛋白6（LRP6）磷酸化，導致LRP6的分解減少，證明鹽霉素是通過下調Wnt途徑LRP6水平以實現促進細胞凋亡的作用，同時結果顯示：鹽霉素能夠下調如LEF1、cyclin D1和纖維蛋白等Wnt靶基因及相關蛋白的表達，表明鹽霉素對HEK293細胞作用主要是通過對Wnt途徑發揮作用來實現的。Fuchs等［31］在鹽霉素克服凋亡抵抗的體外研究中發現：鹽霉素可以促進急性T淋巴細胞白血病患者外周血分離的CD4＋T細胞大量凋亡，而正常的淋巴細胞則不受影響。首先將鹽霉素作用于人急性淋巴母細胞白血病細胞 （MOLT－4）及人外周白血病T細胞 （Jurkat），發現鹽霉素可以促進這2種細胞凋亡。MOLT－4細胞表達野生型p53基因，Jurkat細胞中由于基因突變而不表達p53基因，由于許多抗癌藥物的誘導凋亡作用均依賴p53基因，可以看出鹽霉素可以克服由于p53基因突變而引起的凋亡抵抗作用。然后又將鹽霉素作用于26S蛋白酶體過度表達的淋巴癌 （Namalwa Burkitt細胞），其促進了 Namalwa Burkitt細胞的凋亡，而26S蛋白酶體的過度表達可以使細胞出現凋亡抵抗和惡性增殖。說明鹽霉素可以克服26S過度表達引起的凋亡抵抗。最后，將鹽霉素作用于過度表達P－糖蛋白的人子宮肉瘤細胞 （MES－SA／Dx5），結果同樣促進了MES－SA／Dx5細胞的凋亡，而P－糖蛋白是由癌多耐藥性基因MDR1編碼的一種跨膜糖蛋白［32］，表明鹽霉素能夠克服P－糖蛋白表達引起的凋亡抵抗。因此，鹽霉素可能在急性和慢性淋巴細胞白血病治療中發揮作用。

2.11 鹽霉素與骨肉瘤 Tang等［33］在對鹽霉素和骨肉瘤干細胞進行的體外及體內實驗中，首先利用無血清培養基干細胞成球的特性從骨肉瘤細胞株U2OS、MG63和SAOS2中分理出間充質干細胞 （MSCs），并用傳統的化療藥物甲氨蝶呤 （MTX）作用于 MSCs，結果顯示 MSCs仍然可以成球，提示骨肉瘤細胞中存在的耐甲氨蝶呤的MSCs可以促使腫瘤復發；然后研究者利用鹽霉素作用于MSCs及正常骨髓干細胞，通過成瘤實驗及MTT比色法檢測細胞活性，結果顯示：鹽霉素能夠抑制MSCs的成球率并能降低MSCs活性，而正常骨髓干細胞活性則不受抑制；再采用鹽霉素與MTX聯合用藥，結果顯示：鹽霉素能夠增加MSCs對MTX的敏感性。最后研究者利用裸鼠構建骨肉瘤動物模型并分為對照組、鹽霉素作用組和多柔比星 （ADM）作用組，結果顯示：鹽霉素作用組裸鼠腫瘤生長明顯受抑制，且從裸鼠骨肉瘤分離出的TSCs成瘤能力明顯下降；表明鹽霉素能夠在體內抑制骨肉瘤干細胞的生長。同時利用免疫組織化學法對裸鼠骨肉瘤細胞中β－catenin和cyclin D1進行染色，發現2種蛋白表達均減少；利用蛋白印跡實驗檢測GSK3β，結果顯示GSK3β活性降低，從而導致β－catenin的分解，提示鹽霉素在體內是通過作用于 Wnt／β－catenin途徑以實現對腫瘤細胞的抑制作用。Tang等［33］的實驗結果表明：鹽霉素能夠選擇性地作用于骨肉瘤干細胞，且這種抑制作用與Wnt／β－catenin關系密切，同時又不影響正常骨髓干細胞的活性，這為臨床骨肉瘤治療提供了一個重要線索。

3 結語與展望

近年來的研究［4，9－16，33］表明：癌的復發及耐藥性與癌中存在癌干細胞有密切關系，通過殺傷癌干細胞以達到治療效果成為近些年來的研究熱點與趨勢。通過鹽霉素與多種不同組織來源的癌細胞及癌干細胞作用的研究表明：鹽霉素可能通過多種途徑作用于癌細胞及癌干細胞，鹽霉素有望作為一種新的有效靶向抗癌藥物。

目前已有鹽霉素中毒的相關報道，由于鹽霉素的生物學活性會使細胞內鉀離子聚集而繼發引起鈣離子的增多，而中毒水平的鈣則可激活磷脂酶和蛋白水解酶，從而導致骨骼肌和心肌細胞的損害，嚴重者可導致橫紋肌溶解、急性腎衰、急性心力衰竭、代謝性酸中毒及肺水腫［34－35］。所以鹽霉素對人體的相關毒副作用需要進一步研究與克服。盡管目前鹽霉素對癌細胞的殺傷作用機制尚未完全明確，但并不影響其引領抗癌研究新方向的作用。

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