甲胎蛋白定量方法研究進展

孫雪晴，宋德偉，徐 蓓，武利慶，胡高飛，李紅梅

(1.北京化工大學，北京100029;2.中國計量科學研究院，北京100013)

甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是原發(fā)性肝癌的標志物[1]，為了準確檢測血清中AFP的含量，提高檢測結果的可比性，亟需建立AFP準確測定的量值溯源體系，這對于肝癌患者的早期診斷和病情監(jiān)測非常重要。本文將對AFP的定量方法進行綜述。

AFP是人胚胎期血清中的主要蛋白成分[2-3]，是一種糖蛋白，相對分子質量約70 000[4]。在正常的情況下，這種蛋白主要來自于胚胎的肝細胞[5]。在胎兒出生大約2周后，AFP會從血液中消失，所以正常人的血清中 AFP的含量不足20 μg/L。當肝細胞發(fā)生癌變時，會恢復產生這種蛋白的功能，并且其在血清中的含量會隨著病情的惡化而急劇增加[6]，因此AFP就成為診斷原發(fā)性肝癌的一個特異性臨床指標[7]。另外，AFP在睪丸非精原生殖細胞腫瘤[5]及卵巢生殖細胞腫瘤[8]等患者血清中亦可出現不同程度的升高，因此AFP作為一種重要的腫瘤標志物應用于臨床檢測。

一、AFP含量的量值溯源體系

AFP檢驗結果的準確性直接影響著肝癌等疾病的診斷、治療及預防，因此得到準確且具有跨時空可比性的臨床檢驗結果是防病、治病和提高人類健康水平的基本需要。而實現檢驗結果準確的最有效方法是建立和保證檢驗結果的溯源性[9]。因此實現蛋白質含量測定結果溯源到國際基本單位是蛋白質計量追求的最終目標之一[10]。標準物質是量值的載體，是實現溯源體系的關鍵要素，是保證測量結果在時間和空間上準確和可比的重要基礎，也是實現有效測量即準確、可比、可溯源測量的根本保證。

1975年世界衛(wèi)生組織與各個國家的研究機構合作，研制出臍帶血清凍干的AFP標準物質(72/225)，經8個國家的11個實驗室檢驗比對及國際專家討論后，將其確定為國際通用標準物質用于世界各國研制分析標準物質溯源。臨床檢驗中的分析方法眾多，不同原理的檢驗方法或不同試劑的使用都可能引起測定結果的不同，因此也需要國際通用的方法來配合使用。標準方法的研制對臨床檢驗AFP具有重要的意義。

目前，我國尚未研制出AFP標準物質。隨著現代分析技術的飛速進步，越來越多的臨床分析檢驗儀器引入我國，不同廠家也研制出了許多AFP臨床檢驗試劑盒，由于缺乏高等級標準物質，檢驗結果無法溯源到國家標準，往往出現同一樣本不同醫(yī)院檢驗結果不一致，甚至導致疾病診斷結果相反的情況。因此，為了保證AFP分析檢測結果的準確和可比，我國亟需研制出AFP標準物質及其相關的檢測參考方法，使AFP的標準化得以實現。

二、AFP的定量檢測方法

自1956年在人體血清中發(fā)現AFP的存在以來，AFP的檢測已發(fā)展了多種方法[11-22]，幾乎現有的免疫學檢測方法均可用于AFP的測定。目前國內的臨床檢測主要是利用蛋白定量試劑盒及免疫測定分析儀通過免疫的方法體外測定人血清或血漿中AFP的含量。穩(wěn)定同位素標記技術的發(fā)展為準確定量AFP提供了可能。同位素稀釋質譜法由于具有可絕對測量、敏感性高、測量動態(tài)范圍寬且測量值能直接溯源到國際基本單位等優(yōu)點，近年來被國內外實驗室廣泛用作蛋白準確定量的方法，也是目前公認的蛋白標準物質定值的基準方法。以下分別就免疫分析法及質譜法在定量AFP研究中的應用進行概述。

(一)免疫分析法

自從1959年YALOW等[23]將放射性同位素與免疫反應結合建立了放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)后，發(fā)展了一系列免疫分析法，如酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[24-26]、熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)[27-28]和化學發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[29]等。

1.RIA RIA是利用同位素標記的和未標記的抗原與抗體發(fā)生競爭性抑制反應的方法。1960年YALOW等[30]第1次用RIA檢測了血漿胰島素的含量。隨后RIA受到了許多科研人員和醫(yī)學工作者的關注，得到了廣泛應用。

通過RIA檢測血清中AFP含量成功診斷出了許多早期肝癌。FORRESTER等[11]把用溴化氫活化后的凝膠結合上AFP抗體作為免疫吸附劑，將從臍帶血清中提取出的AFP碘化后，進行了雙抗體放射免疫測定，得到的標準抑制曲線線性范圍為 50 ～1 000 ng/mL。KEMP 等[12]用125I標記的抗體和纖維素耦合的抗體對母體血清中的AFP進行了雙位點RIA檢測，該方法與傳統的RIA相比，大大縮短了檢測的時間。

RIA以其敏感性高、特異性好和實用性強等特點吸引著全國的生物醫(yī)學工作者，但由于操作中始終存在放射性污染、同位素半衰期短及試劑盒性能不穩(wěn)定等問題，人們發(fā)展了一系列非放射性標記技術，如酶標記、化學發(fā)光等。

2.FIA FIA是歷史最悠久的一種標記免疫分析法，敏感性很高，在傳染病診斷上有著極為廣泛的用途。ZHU等[13]用血紅素代替辣根過氧化酶作為對羥基苯和過氧化氫熒光反應的標記物。血紅素標記的和未標記的AFP與AFP單克隆抗體結合后，通過熒光分析進行檢測，得到其檢測的線性范圍是0～380 ng/mL，檢出限為1.0 ng/mL。YANG等[14]用四磺酸基酞菁鐵作為熒光反應的標記物對血清中的AFP進行檢測，得到了類似的結果。AO等[15]基于涂了單克隆抗體的納米球顆粒在異硫氰酸鹽作用下產生熒光淬滅的原理，發(fā)展了一種利用金納米磁性小球快速準確檢測抗原的方法，該方法檢測AFP的檢出限為0.17 nmol/L。

3.免疫酶法(enzyme immunoassay，EIA)EIA是借助酶細胞化學等手段顯示組織抗原或抗體的新技術，這種方法在醫(yī)療實驗室、監(jiān)管機構等領域是一種家喻戶曉的方法，它是在FIA的基礎上發(fā)展起來的。由于FIA具有熒光標本不能長期保存以及需要價格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的不足，1966年NAKANE等[31]嘗試了用酶代替熒光素來標記抗體的方法，從而成功地開創(chuàng)了酶標記抗體的新技術，經過70和80年代的發(fā)展，EIA有了很大的進步，成為了當今使用最為廣泛的免疫組織化學技術。AIZAWA等[32]利用過氧化酶標記的AFP和非標記的AFP與抗體的競爭性結合發(fā)明了一種傳感器，其AFP檢測的線性范圍為10-11～10-8g/mL。

與FIA相比，EIA敏感性較高，標本能夠長期保存，并且能夠假設HE染色等其他付染，有利于將被檢測物質與病變的形態(tài)學改變聯系起來，彌補了FIA的不足。但同時EIA也有其不足之處，因此又在其基礎上發(fā)展了ELISA和CLIA等。

4.ELISA ELISA中最常用的是雙抗體夾心法，其是利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與標本中被檢測抗原分子上的2個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標記抗體免疫復合物，通過測定生成的有色底物的質量來確定待測抗原的含量。XU等[16]發(fā)展了一種夾心式的流動注射異構酶免疫分析法，用電流檢測在酶促反應的過程中生成的對氨基苯酚的含量，從而檢測血清中AFP的含量，測定結果的變異系數＜8.2%，檢出限達到了0.163 μg/L。焦奎等[17]提出了鄰氨基酚-過氧化氫-辣根過氧化物酶伏安酶聯免疫分析測定人體血清AFP的新方法，克服了傳統ELISA光度法測定干擾因素多的缺點，以生物酶作為標記物，利用電化學檢測得到的AFP測定線性范圍為1.25 ～400 mg/L。陳曲波等[18]分別采用微陣列ELISA和電化學發(fā)光免疫分析法對AFP、癌胚抗原及前列腺特異性抗原等6種臨床常見腫瘤標志物進行檢測，結果顯示2種方法檢測AFP的陽性率差異無統計學意義(P＞0.05)，檢測結果具有較好的一致性。

5.CLIA CLIA是分子發(fā)光光譜分析法中的一類，是指物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，而使反應產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，當受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便會發(fā)出一定波長的光。根據化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度或發(fā)光總量來確定組分含量的分析方法即為 CLIA。THORPE 等[19]用 3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽[3-(2-spiroadamatane)-4-methoxy-4-(3-phosphoryloxy)-phenyl-1，2-dioxetane，AMPPD]作為CLIA的基質來檢測人體血清中AFP的含量，AMPPD與酶發(fā)生反應時會在477 nm處發(fā)光。這種方法的AFP定量檢出限為33～470 ng/L。此方法與用堿性磷酸酶的酶免疫比色分析法相比，敏感性提高了67倍，檢出限達到 0.03 μg/mL。ARAKAWA 等[20]將一個抗體標記上 β-d-半乳糖苷酶，另一個抗體涂在聚苯乙烯管上，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷做CLIA的基質來測定人體血清中的AFP含量，檢出限達到0.5 ng/mL，與RIA檢測的線性相關系數達到0.99。榮揚等[21]分別利用光激化學發(fā)光法和酶促化學發(fā)光法測定了血清中AFP和癌胚抗原的含量，得到光激化學發(fā)光法檢測AFP的敏感性為0.112 ng/mL，線性范圍為2.6～950.2 ng/mL，與酶促化學發(fā)光法檢測結果高度相關，可滿足臨床檢驗的要求。

6.免疫傳感器(immunosensor) 免疫傳感器是由偶聯抗原/抗體分子的生物敏感膜與信號轉換器組成的，其是基于抗原和抗體特異性免疫反應的一種生物傳感器[33]。作為一種新興的生物傳感器，具有高度的特異性和極低的檢出限，能夠很好地適應很多領域的分析要求。免疫傳感器可分為無標記型和標記型2種類型，其中無標記型按其測定原理主要分為光學免疫傳感器、電化學免疫傳感器以及壓電免疫傳感器。近年來，發(fā)展了許多用免疫傳感器檢測AFP含量的方法。

光學免疫傳感器結合了免疫分析與光學生物傳感器的優(yōu)點，具有良好的特異性和較低的檢出限。YANG等[34]發(fā)展了一種簡便的熒光生物傳感器定量AFP，該傳感器的原理是基于免疫色譜測試條(immunochromatography test strip，ICTS)上的夾心免疫反應，結合量子點發(fā)強光和高的耐光性以及ICTS的優(yōu)點，該方法在10 min內50μL AFP標準品的檢出限可達到1 ng/mL，對1 000份臨床血清AFP進行檢測，結果與AFP電化學發(fā)光免疫試劑盒檢測結果相比有良好的一致性。

壓電免疫傳感器是近20年發(fā)展起來的新型生物傳感器，它能夠動態(tài)檢測抗原抗體反應，非常利于免疫反應的動力學分析。TYAN等[35]將AFP單克隆抗體通過水溶性的N-乙基-N-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和羥基琥珀酼亞胺作為連接試劑，連接在自組裝單層膜上，從而把AFP單克隆抗體固定在金表面，制成壓電生物傳感器來檢測AFP的含量。該方法的檢出限和線性范圍分別為15和15～850 ng/mL。與RIA測定的結果進行比較，該方法檢測AFP標準品和血清AFP的線性相關系數分別為0.990 3和0.975 0，且具有檢測方法簡便、耗時較短、無需多重標記的優(yōu)點。

電化學免疫傳感器是結合了電化學發(fā)光測量與免疫傳感器的應用，由于其結合了電化學發(fā)光的高敏感性和免疫分析的高選擇性優(yōu)點，已經吸引許多科研人員的關注[36]。納米材料獨特的理化特性使之在高性能的電化學和電化學發(fā)光傳感器的發(fā)展中有很廣闊的應用前景[37]。電化學免疫分析與納米材料的結合可以放大電化學信號，為更敏感地檢測腫瘤標志物提供了全新的方法[38]。SU 等[39]用硫堇/納米金疊層自組裝膜和單層碳納米管做免疫探針，用雙功能金納米顆粒增強信號制成電化學免疫傳感器來檢測人體血清中AFP的含量，并與其他常用臨床免疫學檢測方法的結果進行對比，無明顯差異。該方法檢測AFP的動態(tài)線性范圍是0.25～45 ng/mL，檢出限是0.05 ng/mL。WANG 等[40]用脂質體包裹Ru(bpy)32+作為標記，將電極涂上金納米顆粒，金納米顆粒可以提供大的活性表面，而脂質體可以封閉大量的報道分子，從而能夠增強電化學信號。這樣的免疫傳感器檢測血清中AFP含量的線性范圍為 0.005～0.2 pg/mL，檢出限可達到0.001 pg/mL。GUO 等[41]首次將石墨烯-硫化鎘量子點-瓊脂糖復合物用3-氨基丙基三乙氧基硅烷與玻璃碳電極結合，可增強電化學發(fā)光的信號，從而發(fā)展出一個快速、超敏感的AFP檢測方法，該方法的檢出限和定量限分別是0.000 2和0.000 5 pg/mL。

免疫分析法雖然是一種廉價且有效的分析檢測方法，但由于其具有耗時長，不同的供應商會對檢測結果產生影響，檢測結果不具有跨時空的可比性等缺點，必須發(fā)展一種能直接追溯到國際基本單位、有堅實的理論基礎和嚴格的數學表達的權威方法來保證檢測結果的準確和溯源。

(二)質譜法

基于質譜技術的蛋白質定量方法已經逐漸成為生物醫(yī)學和臨床研究的重要組成部分[42]，在腫瘤標志物的檢測分析中也得到了廣泛的應用[43]。質譜技術可以和免疫分析結合檢測血清中腫瘤標志物的含量。ZHANG等[22]用Eu3+和 Sm3+分別標記AFP和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)抗體后，通過電感耦合等離子體質譜儀同時檢測了AFP和人絨毛膜促性腺激素的含量，得到測量線性范圍分別是2.6 ～500 和 5.0 ～170 μg/L，檢出限分別為 1.2和1.7 μg/L。NICOL 等[44]用類似的方法對肺癌標志物——癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)進行了定量檢測。

同位素稀釋質譜法是將已知質量和豐度的穩(wěn)定同位素作為稀釋劑加入標本中，混合均勻后用質譜測定混合前后同位素豐度的變化，由此計算出標本中該元素含量的方法。目前國際公認的化學測量權威方法有精密庫侖法、同位素稀釋質譜法、重量法、容量法和凝固點下降法等。其中，同位素稀釋質譜法是唯一一種微量、痕量和超痕量元素權威測量方法。蛋白裂解同位素稀釋質譜法可以用來準確定量蛋白質。早在20年前，科研工作者已經第1次嘗試用氘標記的合成肽段作為內標物檢測目標蛋白質[45]。BARNIDGE 等[46]合成了用2個13C和1個15N標記甘氨酸的前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)的1個肽段(IVGGWECEK)，用其作為內標肽段檢測了5種不同濃度的血清PSA含量，所得R2值為0.971。BONDAR等[47]用合成的標記肽段作為內標檢測了血清 Zn-α-2-糖蛋白的含量，所得檢出限為0.08 mg/L。WILLIAMS 等[48]利用同位素稀釋質譜法測定了患有子宮癌的患者血清中C反應蛋白(C reactive protein，CRP)含量，得到的結果與ELISA測定結果的R2值為0.970 8，且發(fā)現利用蛋白裂解同位素稀釋質譜法能檢測到的CRP濃度是ELISA可檢測的10倍。KUHN等[49]用13C標記的CRP特征肽段對患有風濕性關節(jié)炎的患者血清中的CRP含量進行測定，并與健康人體檢測結果進行了對比。

雖然應用同位素稀釋質譜法進行蛋白質準確定量分析的研究已經發(fā)展了很多年，但由于糖蛋白的結構復雜，將其應用于糖蛋白測定的相關報道還較少。目前還未有同位素稀釋質譜法應用于AFP定量研究的報道。

三、展望

隨著生命科學的進步和生物產業(yè)的發(fā)展，生物技術被越來越多地應用于各個領域，其中蛋白質作為一類重要的生物大分子，其分析技術得到了長足的發(fā)展和應用，尤其是臨床檢驗中腫瘤標志物的測定受到了廣大科研工作者的重視。目前，我國還沒有AFP相應的標準物質和參考方法，檢驗結果無法實現溯源，這對臨床診斷和篩查結果會產生較大的影響。因此，建立AFP含量量值溯源傳遞體系是亟待解決的問題。同位素稀釋質譜法因其具有敏感性高、準確度高且測量結果可溯源至國際基本單位等優(yōu)點，是AFP標準物質研制的潛在方法。AFP是一種糖蛋白，在準確定量技術上還有很大的研究和探討空間。中國計量院科技支撐計劃目前已經開展AFP等腫瘤標志物標準物質的研究，以期為腫瘤標志物標準化奠定基礎。

[1]李麗.巖藻糖基化修飾蛋白在原發(fā)性肝細胞癌中的研究進展[J].檢驗醫(yī)學，2012，27(4):324-328.

[2]盧仁泉，鄭佐婭，郭林.聯合檢測甲胎蛋白和癌胚抗原的膠體金免疫層析試劑的研制及性能評價[J].檢驗醫(yī)學，2009，24(12):899-903.

[3]吉強，顧星，高春芳.甲胎蛋白及其單核苷酸多態(tài)性與肝細胞癌易感性的研究[J].檢驗醫(yī)學，2013，28(2):168-170.

[4]XIONG P，GAN N，CAO Y，et al.An ultrasensitive electrochemical immunosensor for alpha-fetoprotein using an envision complex-antibody copolymer as a sensitive label[J].Mater，2012，5(12):2757-2772.

[5]WON YS，LEE SW. Targeted retardation of hepatocarcinoma cells by specific replacement of alpha-fetoprotein RNA [J].J Biotechnol，2007，129(4):614-619.

[6]MURRAY MJ，COLEMAN N.Testicular cancer:a new generation of biomarkers for malignant germ cell tumours[J].Nat Rev Urol，2012，9(6):298-300.

[7]PATIL M，SHETH KA，ADARSH CK.Elevated alpha-fetoprotein，no hepatocellular carcinoma[J].J Clin Exp Hepat，2013，3(2):162-164.

[8]SEKIYA S，INABA N，IWASAWA H，et al.AFP-producing Sertoli-Leydig cell tumor of the ovary[J].Arch Gynecol，1985，236(3):187-196.

[9]戴新華，李紅梅，齊韜.臨床檢驗量值溯源及其標準物質的研究現狀[J].化學分析計量，2007，16(5):7-9.

[10]武利慶，王晶，楊彬，等.蛋白質含量標準物質研究現狀及趨勢[J].計量學報，2010，31(z1):73-75.

[11]FORRESTER PI，HANCOCK RL，HAY DM，et al.A rapid method forthepurification and radioimmunoassay of human alpha-fetoprotein[J].Clin Chim Acta，1975，64(3):317-323.

[12]KEMP HA，SIMPSON JS，WOODHEAD JS.Automated two-site immunoradiometric assay of human alpha-fetoprotein in maternal serum[J].Clin Chem，1981，27(8):1388-1391.

[13]ZHU QZ，LIU FH，XU JG，et al.Fluorescence immunoassay of α-1-fetoprotein with hemin as a mimetic enzyme labelling reagent[J].Fresenius J Anal Chem，1998，362(6):537-540.

[14]YANG HH，ZHU QZ，LI DH，et al.Fluorescence immunoassay of alpha-fetoprotein with iron(Ⅲ)tetrasulfonatophthalocyanine as a mimetic enzyme labeling reagent[J].Fresenius J Anal Chem，2001，370(1):88-91.

[15]AO L，GAO F，PAN B，et al.Fluoroimmunoassay for antigen based on fluorescence quenching signal of gold nanoparticles[J].Anal Chem，2006，78(4):1104-1106.

[16]XU Y，HALSALL B，HEINEMAN WR.Heterogeneous enzyme immunoassay of alpha-fetoprotein in maternal serum by flow-injection amperometric detection of 4-aminophenol[J].Clin Chem，1990，36(11):1941-1944.

[17]焦奎，張書圣，陳洪淵.鄰氨基酚-過氧化氫-辣根過氧化物酶伏安酶聯免疫分析法測定人血清甲胎蛋白[J].分析化學，1998，27(6):766-768.

[18]陳曲波，黃嫵姣，黎翠翠，等.Array-ELISA法和ECLIA法測定六項腫瘤標志物的比較研究[J].檢驗醫(yī)學，2012，27(1):4-7.

[19]THORPE GH，BRONSTEIN I，KRICKA LJ，et al.Chemiluminescent enzyme immunoassay of alphafetoprotein based on adamantyl dioxetane phenyl phosphate substrate[J].Clin Chem，1989，35(12):2319-2321.

[20]ARAKAWA H，IKEGAMI T，MAEDA M，et al.Chemiluminescent enzyme immunoassay for alphafetoprotein using beta-D-galactosidase as label and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside as substrate[J].J Biolumin Chemilumin，1993，8(3):135-139.

[21]榮揚，趙強元，劉敏，等.光激化學發(fā)光法定量測定AFP和 CEA的性能評價[J].檢驗醫(yī)學，2013，28(2):146-149.

[22]ZHANG S，ZHANG C，XING Z，et al.Simultaneous determination of alpha-fetoprotein and freebetahuman chorionic gonadotropin by element-tagged immunoassay with detection by inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Clin Chem，2004，50(7):1214-1221.

[23]YALOW RS，BERSON SA.Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods[J].Nature，1959，184(Suppl 21):1648-1649.

[24]KURITA R，ARAI K，NAKAMOTO K，et al.Development of electrogenerated chemiluminescencebased enzyme linked immunosorbent assay for sub-pM detection[J].Anal Chem，2010，82(5):1692-1697.

[25]RISSIN DM，KAN CW，CAMPBELL TG，et al.Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations[J].Nat Biotechnol，2010，28(6):595-599.

[26]XIA W，YANG T，SHANKAR G，et al.A specific enzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with alzheimer disease[J].Arch Neurol，2009，66(2):190-199.

[27]BRUCHEZ M Jr，MORONNE M，GIN P，et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science，1998，281(5385):2013-2016.

[28]BOLDT K，BRUNS OT，GAPONIK N，et al.Comparative examination of the stability of semiconductor quantum dots in various biochemical buffers[J].J Phys Chem B，2006，110(5):1959-1963.

[29]OLD JB，SCHWEERS BA，BOONLAYANGOOR PW，et al.Developmental validation of RSID-saliva:a lateral flow immunochromatographic strip test for the forensic detection of saliva [J].J Forensic Sci，2009，54(4):866-873.

[30]YALOW RS，BERSONSA. Immunoassayof endogenous plasma insulin in man.1960[J].Obes Res，1996，4(6):583-600.

[31]NAKANE PK，PIERCE GB Jr. Enzyme-labeled antibodies:preparation and application for the localization of antigens [J].J Histochem Cyto，1966，14(12):929-931.

[32]AIZAWA M，MORIOKA A，SUZUKI S.An enzyme immunosensor for the electrochemical determination of the tumor antigen α-fetoprotein [J].Analytica Chimica Acta，1980，115(15):61-67.

[33]EKINS R，CHU F.Immunoassay and other ligand assays:present status and future trend[J].Int Fed Clin Chem，1997，9(3):100-109.

[34]YANG Q，GONG X，SONG T，et al.Quantum dotbased immunochromatography test strip for rapid，quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein[J].Biosens Bioelectron，2011，30(1):145-150.

[35]TYAN YC，YANG MH，CHUNGTW，etal.Characterization ofsurface modification on selfassembled monolayer-based piezoelectric crystal immunosensor for the quantification of serum αfetoprotein[J].J Mater Sci Mater Med，2011，22(6):1383-1391.

[36]CHEN H，ZHANG B，CUI Y，et al.One-step electrochemical immunoassay of biomarker based on nanogold-functionalized graphene sensing platform[J].AnalyticalMethods，2011，3(7):1615-1621.

[37]SHIM JH，KIM J，CHA GS，et al.Glass nanoporebased ion-selective electrodes[J].Anal Chem，2007，79(10):3568-3574.

[38]LIU G，LIN Y.Nanomaterial labels in electrochemical immunosensors and immunoassays[J].Talanta，2007，74(3):308-317.

[39]SU B，TANG J，CHEN H，et al.Thionine/nanogold multilayer film for electrochemical immunoassay of alpha-fetoprotein in human serum using biofunctional double-codified gold nanoparticles[J].AnalyticalMethods，2010，2(11):1702-1709.

[40]WANG H，SUN D，TAN Z，et al.Electrochemiluminescence immunosensor for α-fetoprotein using Ru(bpy)32(2+)-encapsulated liposome as labels[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2011，84(2):515-519.

[41]GUO Z，HAO T，DUAN J，et al. Electrochemiluminescence immunosensor based on graphene-CdS quantum dots-agarose composite for the ultrasensitive detection of alpha fetoprotein[J].Talanta，2012，89:27-32.

[42]GONZáLEZ-BUITRAGO JM，FERREIRAL L，LORENZO I.Urinary proteomics[J].Clin Chim Acta，2007，375(1-2):49-56.

[43]ACKERMANN BL，BERNA MJ. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers[J].Expert Rev Proteomics，2007，4(2):175-186.

[44]NICOL GR，HAN M，KIM J，et al.Use of an immunoaffinity-mass spectrometry-based approach for the quantification of protein biomarkers from serum samples of lung cancer patients[J].Mol Cell Proteomics，2008，7(10):1974-1982.

[45]DESIDERIO DM，KAI M，TANZER FS，et al.Measurement of enkephalin peptides in canine brain regions，teeth，and cerebrospinal fluid with highperformance liquid chromatography and mass spectrometry[J].J Chromatogr，1984，297:245-260.

[46]BARNIDGE DR，GOODMANSON MK，KLEE GG，et al.Absolute quantification of the model biomarker prostate-specific antigen in serum by LC-MS/MS using protein cleavage and isotope dilution mass spectrometry[J].J Proteome Res，2004，3(3):644-652.

[47]BONDAR OP，BARNIDGE DR，KLEE EW，et al.LC-MS/MS quantification of Zn-alpha 2 glycoprotein:a potential serum biomarker for prostate cancer[J].Clin Chem，2007，53(4):673-678.

[48]WILLIAMS DK，MUDDIMAN DC. Absolute quantification of C-reactive protein in human plasma derived from patients with epithelial ovarian cancer utilizing protein cleavage isotope dilution mass spectrometry[J].J Proteome Res，2009，8(2):1085-1090.

[49]KUHN E，WU J，KARL J，et al.Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards[J].Proteomics，2004，4(4):1175-1186.