腫瘤抑制因子VHL及其結合蛋白VBP1研究進展

張海峰，周建峰

（中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室，山東 青島 266003）

抑癌基因von Hipplel－Lindau（VHL）得名于一類十分罕見的家族性顯性遺傳病——VHL綜合征，該病病人罹患腫瘤的概率顯著升高［1］。VHL基因定位在人類3號染色體短臂上（3p25－p26），包含3個外顯子，編碼一個由213個氨基酸組成的蛋白［2］。VHL蛋白的缺失與VHL綜合征相關腫瘤的發生和發展關系密切。距VHL基因首次被鑒定和克隆已經有20多年的時間，到目前為止對VHL功能的研究也已經比較深入，VHL最廣為人知的功能當屬它作為E3泛素化連接酶復合體的一個組分促進缺氧誘導因子1，α亞基（HIF1α）的降解。而von Hippel－Lindau binding protein 1（VBP1）最早是作為抑癌因子VHL的結合蛋白被鑒定出來的，并因此而得名。同時，它還是前折疊素（PFD）異源六聚體的一個組成亞基，稱為PFD3。VBP1作為PFD的一個亞基可以幫助新合成的多肽與其分子伴侶結合以完成翻譯后的折疊［3］。

1 VHL綜合征及腫瘤抑制因子VHL的功能

1.1 VHL綜合征

VON等［4］和 LINDAU［5］在20世紀初期首先對 VHL綜合征進行了描述，VON描述了一個視網膜血管瘤患病率很高的家族，而LINDAU［5］報道這些視網膜腫瘤通常出現在中樞神經系統病變處的附近。該疾病也因此得名于二人的名字組合。現在已經知道VHL綜合征是一種可遺傳的腫瘤征候群，目前，該病發病率約為1／35000。VHL疾病的病人體內良性腫瘤的發生率明顯升高，腫瘤主要出現在中樞神經系統（成血管細胞瘤）、視網膜（血管瘤）及腎上腺（嗜鉻細胞瘤）等部位。此外，許多病人還會產生腎臟惡性腫瘤——腎透明細胞瘤（ccRCC）［6］。現已證明VHL綜合征的出現是由VHL基因的胚系突變引起的。根據不同的患病類型對VHL綜合征病人進行分類，1型病人表現為患血管母細胞瘤，但患嗜鉻細胞瘤和ccRCC的概率較低，2型病人同樣患血管母細胞瘤，且患嗜鉻細胞瘤的概率也很高，2型病人又可以被細分為2A（患ccRCC概率低）、2B（患ccRCC概率高）和2C（不患ccRCC）［6］。VHL蛋白不同位置的突變能提高特定類型腫瘤的患病概率，這也支持VHL蛋白作為腫瘤抑制因子功能多樣的主張。

1.2 VHL蛋白的功能

1.2.1 VHL是E3泛素化連接酶的一個組分 VHL蛋白沒有酶活性，但它能夠與許多其他蛋白結合從而發揮功能。蛋白質的泛素化需要由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2以及泛素連接酶E3共同作用完成。VHL能夠與elongins B、elongins C、cullin 2 以 及 Rbx－1 形 成 elongin／cullin／VHL（ECV）復合體［7－8］，其結構和功能 類似于 酵母中的 Skp1／Cdc53／F－box蛋白（SCF）多重復合體，具有E3泛素化連接酶活性，能使蛋白質底物泛素化。在ECV復合體中VHL作為底物識別亞基發揮作用［9］。轉錄因子－HIF家族是VHL介導的泛素化蛋白中被研究最廣泛可能也是最重要的一種底物蛋白［10］。ECV復合體通過VHL的β－結構域識別并結合羥基化的 HIF1α，VHL E3泛素化連接酶通過與HIF1α氧依賴降解（ODD）結構域的核心部位物理結合從而對HIF1α進行泛素化修飾，泛素化的HIF1α會迅速通過26S蛋白酶體途徑降解［11］。除了HIF1α之外，ECV復合體還有其他一些靶蛋白，包括蛋白激酶C（PKC）［12］及過度磷酸化的Rpb1［13］等。有研究表明，PKC在調節c－Jun依賴的神經元細胞凋亡中具有重要作用，而后者是嗜鉻細胞瘤細胞潛在的前體［14］。Rpb1是RNA聚合酶Ⅱ的一個亞基，RNA聚合酶Ⅱ會在紫外輻射后被激活，與壓力誘導的轉錄密切相關［13］。當然，并不是所有的蛋白與VHL結合都會發生泛素化，相反有某些VHL突變與一些泛素化功能正常的腫瘤發生有關，其中也包括HIF1α泛素化正常的情況。例如，2C型的VHL疾病病人HIF1α的泛素化并無異常，但他們出現嗜鉻細胞瘤的可能性仍顯著升高［15］。所以，類似于2C型病人的VHL突變促進腫瘤發生可能不依賴于ECV復合體和HIF的功能。對VHL除介導蛋白泛素化外的其他功能進行調查，發現該蛋白的功能多樣。

1.2.2 VHL參與細胞外基質（ECM）的調節 有研究證明，VHL能夠協助ECM的調控，在ECM環境中VHL的缺失能夠使血管更容易浸潤到腫瘤中從而促進血管的生成。VHL及纖連蛋白能夠與整合素相互作用，從而共同調控ECM［16］。VHL缺失的細胞中纖連蛋白的分泌量有所升高，但是作為ECM的一部分，它的組裝是紊亂的，而在這些細胞中重新引入野生型的VHL能夠使之恢復正常［17］。因此，VHL和纖連蛋白的相互作用缺失會導致ECM生成的缺陷。近期有報道稱在VHL缺失的腎癌細胞中ECM的缺陷與RhoA GTPase活性的降低有關［17］。VHL還能夠與膠原蛋白IVα2（COL4α2）結合［18］，VHL缺失能夠使 COL4α2從ECM中消失［19］，從而使VHL缺失的腫瘤進一步解除對ECM結構的控制。

1.2.3 VHL參與細胞增殖和凋亡的調控 有證據表明，VHL的功能還涉及對凋亡調控因子的調節，包括腫瘤抑制因子p53、核因子－κB（NF－κB）以及轉錄因子E2F1。p53與多種腫瘤如子宮頸癌的發生發展密切相關［20］。在正常情況下，作為對DNA損傷或是其他刺激的應答，p53能夠促進細胞周期阻滯和細胞凋亡。ROBERTS等［21］證明在ccRCC中，伴隨VHL缺失導致的HIF2α穩定能夠促進Hdm2對p53的抑制作用，這也是VHL調控細胞存活的一種可能的作用機制。另外，VHL缺失能夠使NF－κB的活性升高。NF－κB活性升高能通過激活抗凋亡及增殖信號通路來促進腫瘤的發生，其在胰島細胞凋亡及胰島素抵抗中的作用也受到廣泛重視［22］。在正常情況下VHL能結合酪蛋白激酶2（CK2）并促進Card9的磷酸化，而磷酸化的Card9是NF－κB的激動劑，據此研究人員提出了伴隨Card9磷酸化的增強（通常伴隨VHL的缺失）NF－κB的活性也隨之增強的作用機制［21］。而在VHL缺失的ccRCC細胞中抑制Card9能使NF－κB的活性恢復正常，進一步證明了這種機制的可靠［21］。此外，WANG等［23］最近研究證實，VHL能夠與雄激素受體（AR）相互作用，抑制其轉錄活性并抑制雄激素受體誘導的細胞增殖，但VHL并沒有誘導雄激素受體的泛素化降解。

2 VHL結合蛋白VBP1及PFD復合體

2.1 PFD的結構和功能

在復雜的細胞環境中，許多蛋白需要在一個或多個分子伴侶家族成員的幫助下完成正確折疊從而變成有活性的天然蛋白［24］。在眾多分子伴侶中，伴侶蛋白是十分重要的一類，在所有已知的物種中均能找到伴侶蛋白的存在。伴侶蛋白發揮其生物學功能還需要其他分子伴侶的幫助。例如，PFD通過將未折疊的蛋白傳送到伴侶蛋白空腔內而幫助古細菌和真核生物中的Ⅱ型伴侶蛋白發揮功能［3］。PFD最早是在對酵母的遺傳研究中被發現的，它廣泛地存在于古細菌及真核生物中，是一種異源六聚體蛋白。在真核生物中的PFD由6種不同的蛋白構成，其中兩種類似于α亞基，4種類似于β亞基［3］。

有研究證實，真核生物的PFD能選擇性地結合肌動蛋白及微管蛋白，之后PFD能特異結合細胞質中的伴侶蛋白CCT并將底物蛋白傳遞給它，以完成后續的折疊組裝［25］。因為有絲分裂的細胞對微管蛋白的需求量很大，所以在秀麗隱桿線蟲中刪除PFD對其胚胎是致死的［26］。在酵母中刪除PFD并不會致死，但也會對生長產生影響，且具有細胞骨架缺陷的表型特點［3］。考慮到PFD是一種異源六聚體，SIMONS等［27］假設PFD 6個不同的亞基對其與肌動蛋白及微管蛋白的結合貢獻也是不同的，因此他們將PFD各亞基的卷曲螺旋觸手頂端分別刪除，構建了單個亞基有缺陷的雜合體PFD。正如預期，截短PFD3和PFD4能夠消除PFD與肌動蛋白的結合，而截短PFD4和PFD 5能夠消除PFD與微管蛋白的結合［28］。盡管SIMONS等［27］并沒有直接闡明PFD卷曲螺旋觸手與底物相互結合的分子機制，但真核生物PFD能夠識別其底物并以特定方向與之結合的事實，暗示特異性結合可能是通過序列特異性來實現的。在植物中，PFD6對微管的動態循環及結構組織是必需的。敲除PFD1的小鼠具有明顯的細胞骨架缺陷的特點，包括纖毛運動障礙、神經元缺失、B細胞和T細胞發育及功能缺陷等［29］。另外，小鼠的PFD5突變，會導致突變小鼠的光感受器退化、中樞神經系統異常以及雄性不育［30］。上述兩種小鼠表型的產生也都與纖毛及細胞骨架功能相關，由此可以得出，PFD對微管的組裝及細胞骨架的結構和功能都具有重要作用。

2.2 VBP1的功能

目前對于VBP1功能的研究還相對較少，主要圍繞它作為VHL結合蛋白的功能展開。有報道稱VBP1參與了伴侶蛋白CCT介導的VHL與延伸因子B和C（VBC）復合體的形成［31］。而且，VBP1還能夠作為HIV－1整合酶與VHL結合的橋梁，介導整合酶的降解［32］。另外，VBP1被證實能夠促進α和γ微管蛋白的形成和組裝［33］，而VHL則能夠影響微管的穩定性［20］，這也暗示二者可能協同發揮作用。確實，在果蠅中敲除VBP1的同系物Mgr能夠降低微管蛋白的穩定性，而當Mgr與VHL一同敲除之后能夠部分營救這種表型，證明VBP1可以與VHL一起調控微管蛋白的穩定性［34］。此外，最近的研究表明，VBP1能夠與MSH4結合并促進MSH4的泛素化，促使其通過蛋白酶體及自噬介導的途徑降解［35］，這也暗示VBP1可能參與到VHL介導的泛素化降解途徑。

3 前景與展望

一方面，目前對VHL功能以及該蛋白的缺失是如何促進腫瘤發生機制的研究已取得了巨大的進步。不過，VHL對腫瘤的抑制作用的機制還沒有完全被闡明，VHL的新功能仍有待進一步發掘。并且，對VHL特定的突變類型與特定腫瘤發病的升高間的聯系了解還相對較少。另外，HIF的穩定以及轉錄激活活性升高會導致許多表觀遺傳學特征的改變，且過度甲基化是ccRCC的一個重要特征，也預示著VHL的缺失與表觀遺傳的改變密切相關。另一方面，目前對VBP1的研究還不夠深入，它與VHL結合之后的功能還未被確切闡明。另外，VBP1作為PFD的一個亞基，它在該復合體中的具體功能仍有待進一步研究。不過已有一些證據支持VHL與VBP1能夠相互協作，而在該系統中VBP1或PFD能決定底物蛋白是被送到伴侶蛋白CCT中折疊還是經VHL泛素化之后通過蛋白酶體途徑降解。綜上所述，繼續對VHL及其結合蛋白VBP1的功能進行深入研究具有重要的醫學及生物學價值。

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