分子病理學(xué)技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用

董賀 孫青

·述評(píng)·

分子病理學(xué)技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用

董賀 孫青★

近幾十年來(lái)，新興學(xué)科——分子病理學(xué)的出現(xiàn)，使得人類對(duì)疾病特別是腫瘤的研究從器官、組織、細(xì)胞水平深入到蛋白、染色體和DNA水平。這不僅能為病理診斷提供更準(zhǔn)確、更客觀的依據(jù)，且可更好地指導(dǎo)腫瘤的靶向治療和預(yù)后判斷等，極大地推動(dòng)了病理學(xué)的發(fā)展。分子病理學(xué)的技術(shù)如免疫組化、原位雜交、基因突變檢測(cè)、生物芯片、流式細(xì)胞術(shù)等，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，并將在未來(lái)的醫(yī)療領(lǐng)域里扮演越來(lái)越重要的角色。本文就近年來(lái)分子病理學(xué)技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

分子病理學(xué)技術(shù)；腫瘤診治

傳統(tǒng)病理學(xué)通常分為診斷病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)病理學(xué)。前者通過(guò)尸體解剖（autopsy）、活體組織檢查（biopsy）和細(xì)胞學(xué)（cytology）檢查對(duì)疾病做出最終診斷；后者則以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或在體外培養(yǎng)的細(xì)胞為材料進(jìn)行研究。近幾十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展和免疫組化、原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)的應(yīng)用，極大地推動(dòng)了病理學(xué)的發(fā)展，逐漸形成了一門新的分支學(xué)科——分子病理學(xué)，使得對(duì)疾病特別是腫瘤的研究從器官、組織、細(xì)胞水平深入到蛋白、染色體和DNA水平；并使形態(tài)學(xué)觀察從定性走向定位、定量，更具客觀性和可重復(fù)性。而分子病理學(xué)技術(shù)能為病理診斷提供更準(zhǔn)確、更客觀的依據(jù)，從而更好地指導(dǎo)腫瘤的靶向治療和預(yù)后判斷等，是現(xiàn)代病理學(xué)發(fā)展的方向和必不可少的手段。下面就相關(guān)分子病理學(xué)技術(shù)在腫瘤診治中的應(yīng)用作簡(jiǎn)要介紹。

1 免疫組織化學(xué)（immunohistochem istry，IHC）

免疫組織化學(xué)是在蛋白水平上，利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)和定位組織和細(xì)胞中某種蛋白成分的技術(shù)。免疫組化技術(shù)有較高的特異性和敏感性，能同時(shí)將細(xì)胞成分定位與形態(tài)學(xué)改變結(jié)合起來(lái)，且直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測(cè)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析等技術(shù)，可對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)、細(xì)胞屬性和來(lái)源的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)的檢測(cè)等。如對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行ER、PR、HER2的檢測(cè)可以判斷患者的預(yù)后和對(duì)靶向治療藥物（赫賽汀等）的敏感性及指導(dǎo)內(nèi)分泌治療［1］；進(jìn)行ERCC、RRM 1、TS、TOPOIIA、β-tubulin-Ⅲ等耐藥基因蛋白表達(dá)的檢測(cè)，以預(yù)測(cè)其對(duì)抗腫瘤化療藥物如鉑類、吉西他濱、培美曲賽和紫杉醇類的療效等［2－3］。

2 原位雜交（in situ hybridization，ISH）

原位雜交是用經(jīng)標(biāo)記的核苷酸片段作為探針，通過(guò)雜交直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測(cè)和定位某一特定靶基因存在與否的技術(shù)。ISH的原理是DNA變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。根據(jù)探針標(biāo)記物的不同，如熒光素、地高辛、生物素、放射性物質(zhì)等，又分為熒光原位雜交，顯色原位雜交，銀染原位雜交等。

2.1 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

FISH可以檢測(cè)基因（染色體）在較大的范圍內(nèi)發(fā)生的異常改變，如基因擴(kuò)增、基因缺失、染色體轉(zhuǎn)位或染色體數(shù)目變化等，因其性能穩(wěn)定和結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，已有很多商品化的試劑盒，如美國(guó)Vysis、北京金菩嘉、廣州安必平等。目前主要被用于乳腺癌和胃癌HER2基因擴(kuò)增，尿路上皮癌、宮頸癌、淋巴瘤、白血病、性染色體的檢測(cè)和產(chǎn)前診斷。在免疫組化檢測(cè)乳腺癌和胃癌HER2蛋白表達(dá)意義不明確時(shí)，需做FISH檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證其有無(wú)HER2基因的擴(kuò)增，以正確指導(dǎo)赫賽汀的應(yīng)用；此外還對(duì)化療以及疾病的預(yù)后預(yù)測(cè)有重要的指導(dǎo)意義［4］，是判斷HER2基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)。FISH一般采用雙色探針標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)比鮮明，紅色信號(hào)和綠色信號(hào)融合時(shí)可產(chǎn)生黃色信號(hào)，可用于一些融合或轉(zhuǎn)位基因的判斷。缺點(diǎn)是需配備熒光顯微鏡及采圖軟件（FISH工作站），且玻片不能長(zhǎng)期保存。

2.2 顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization，CISH）

CISH的應(yīng)用也很廣泛，即一般意義的原位雜交。利用生物素和親合素系統(tǒng)標(biāo)記探針和第一抗體，用辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記第二抗體，以DAB系統(tǒng)顯色后，就可在組織切片上把目的DNA標(biāo)記出來(lái)。如應(yīng)用原位雜交法檢測(cè)人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、EB病毒（epstein-barr virus，EBV）等。原位雜交與免疫組化相比，具有高度特異性，尤其在無(wú)法得到可靠抗體時(shí)，不失為一種較好的檢測(cè)方法。在普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察且能長(zhǎng)期保存是其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是操作步驟多，易出現(xiàn)不穩(wěn)定因素和人為差異［5］。

2.3 銀染原位雜交（silver in situ hybridization，SISH）

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的SISH技術(shù)，將銀沉淀和酶標(biāo)記顯色方法相結(jié)合，把HER2基因標(biāo)記為黑色信號(hào)，染色體著絲粒標(biāo)記為紅色信號(hào)，標(biāo)記過(guò)程在全自動(dòng)免疫組化機(jī)上進(jìn)行，并能在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并判讀，且能永久保存，結(jié)果與FISH符合率高，可達(dá)94～99％［6－7］。隨著探針成本的降低其將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

3 基因突變檢測(cè)

近年來(lái)興起的針對(duì)腫瘤的靶向治療，與傳統(tǒng)的化學(xué)療法相比，其特點(diǎn)在于能選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞低損傷或無(wú)損傷，具有高選擇性和不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。而實(shí)現(xiàn)有效靶向治療建立在檢測(cè)靶基因是否發(fā)生突變的基礎(chǔ)上。因此，基因突變檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)腫瘤的靶向治療非常關(guān)鍵。其中有些已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，如EGFR基因突變檢測(cè)易瑞沙和特羅凱等靶向藥物是否適用于非小細(xì)胞肺癌患者［8］，KRAS基因突變檢測(cè)西妥昔和帕尼等是否適用于結(jié)直腸癌患者［9］，KIT和PDGFRA基因突變檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤患者是否會(huì)對(duì)靶向治療藥物伊馬替尼產(chǎn)生耐藥性［10］等。

基因突變是指染色體上一個(gè)位點(diǎn)內(nèi)遺傳物質(zhì)的變化，主要形式有點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、基因易位或重排、甲基化及其他方式導(dǎo)致的基因結(jié)構(gòu)異常?；蛲蛔儗?dǎo)致的癌基因突變、抑癌基因失活、基因表達(dá)失調(diào)等是腫瘤發(fā)生的重要因素。目前檢測(cè)基因突變的方法有測(cè)序法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR法、高分辨率熔解曲線法、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法等。

3.1 基因測(cè)序（gene sequencing，GS）

此技術(shù)能夠最真實(shí)地反映基因上的信息，被普遍認(rèn)為是分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前已由經(jīng)典的Sanger測(cè)序發(fā)展到二代測(cè)序技術(shù)，如Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)以及ABI公司的SOLiD技術(shù)等；測(cè)序通量也急速提高，費(fèi)用則大大降低［11－12］。相對(duì)于Sanger測(cè)序，其它方法盡管靈敏度或特異度有所提高，但只能針對(duì)一些已知的常見(jiàn)突變進(jìn)行，不能用于檢測(cè)罕見(jiàn)或未知突變。而Sanger測(cè)序的缺點(diǎn)則是檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)；對(duì)標(biāo)本中所含腫瘤組織的量要求比較高，且敏感性低，一般不能檢出低于20％的突變［13］。

3.2 高分辨率熔解曲線（high resolutionmelting，HRM）

HRM是一種在實(shí)時(shí)定量熒光PCR的基礎(chǔ)上，通過(guò)飽和染料監(jiān)測(cè)核酸的熔解曲線變化并進(jìn)行分析的方法。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)不匹配會(huì)使雙鏈DNA在升溫過(guò)程中先解開(kāi)，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。HRM檢測(cè)無(wú)需使用序列特異性探針，不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，具有高靈敏度、成本低、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于突變篩選、基因分型等多方面［14－15］。由于HRM能夠?qū)螇A基差異進(jìn)行區(qū)分，所以對(duì)溫度分辨率的要求相當(dāng)高，需要特定的儀器或配件。Ma等［16］分別用直接測(cè)序法和HRM方法檢測(cè)了100例結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變，HRM方法可檢出11種突變類型，較測(cè)序法更為敏感，兩種方法的一致性達(dá)95％。

3.3 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）

ARMS法利用擴(kuò)增阻滯突變的原理設(shè)計(jì)探針，如其中EGFR 29型的試劑盒涵蓋了EGFR基因的29個(gè)突變點(diǎn)，包括3種18外顯子突變、19種19外顯子突變、5種20外顯子突變和2種21外顯子突變等，能檢測(cè)絕大多數(shù)已知的EGFR基因突變類型。此法靈敏度高，能檢出1％的常見(jiàn)突變，尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞含量較少的樣本，如穿刺、體液樣本等具有很大的優(yōu)勢(shì)［17］；且其操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，若與Sanger測(cè)序聯(lián)合應(yīng)用將使診斷更全面可靠。

4 生物芯片

生物芯片技術(shù)是近來(lái)影響深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融生物學(xué)、微電子學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等為一體的前沿技術(shù)。該技術(shù)將高密度的核酸、蛋白質(zhì)、組織等包被在硅片、玻片等固相支持物上，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的用途，如基因表達(dá)譜研究、基因突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、產(chǎn)前診斷、分子標(biāo)志物篩選等，為功能基因組的研究及醫(yī)學(xué)診斷的發(fā)展提供了有力的工具。

4.1 基因芯片

采用基因芯片可分析患者和腫瘤高發(fā)人群的基因表達(dá)譜，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，為發(fā)現(xiàn)腫瘤致病基因提供線索；同時(shí)通過(guò)檢測(cè)突變基因，還對(duì)具有發(fā)生腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體提前預(yù)警；并使基于廣泛基因表達(dá)分析的腫瘤分類方法成為可能，以區(qū)分利用常規(guī)手段難以辨明的腫瘤，提高了診斷的準(zhǔn)確率［18］。在產(chǎn)前診斷方面，基因芯片由于成本限制，尚未成為主流手段，但其相對(duì)于傳統(tǒng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)，仍具有高分辨率的優(yōu)勢(shì)和廣闊的前景［19］。

4.2 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)提供了理想工具?，F(xiàn)已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，利用蛋白質(zhì)芯片來(lái)檢測(cè)腫瘤相關(guān)的血清蛋白，并利用聯(lián)合診斷的方法對(duì)樣品進(jìn)行分級(jí)［20－21］。如卵巢癌單個(gè)腫瘤標(biāo)志物CA125已經(jīng)被IL-18、FGF-2和CA125聯(lián)合診斷所取代［22］。由于血清蛋白的變化受性別、激素水平及營(yíng)養(yǎng)狀況等影響，而對(duì)腫瘤組織進(jìn)行原位研究可以避免這些影響。Melle等［23］利用蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)和顯微切割技術(shù)分析頭頸部腫瘤組織及其鄰近淋巴結(jié)，找出了2個(gè)有顯著差異表達(dá)的蛋白，未來(lái)可以作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的新指標(biāo)。

4.3 組織芯片

組織芯片將很多微小組織整齊地排列在一起，從而提供了一種高通量、大樣本以及快速的疾病形態(tài)學(xué)分析工具。組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的病理學(xué)相結(jié)合，可做HE染色、特殊染色、免疫組化、原位雜交等。它的優(yōu)點(diǎn)是具有良好的內(nèi)對(duì)照和實(shí)驗(yàn)條件的一致性。林茂松等［24］采集了54例直腸癌組織和40例癌旁直腸粘膜組織制成組織芯片，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了多種蛋白因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53、CyclinD1、Bcl-2的異常表達(dá)與直腸癌的發(fā)生有關(guān)。

5 其他方法

5.1 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)，適用于單細(xì)胞懸液的樣本（可以是血液、體液和細(xì)胞培養(yǎng)懸液），它是免疫細(xì)胞化學(xué)、激光和計(jì)算機(jī)科學(xué)綜合的產(chǎn)物。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤診治領(lǐng)域現(xiàn)也得到了廣泛的應(yīng)用。DNA非整倍體的出現(xiàn)是癌前病變向早期癌變發(fā)展的一個(gè)重要指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)可測(cè)定DNA含量的變化，即DNA非整倍體的出現(xiàn)，對(duì)癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)做出評(píng)估，有助于癌變的早期診斷。流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用在白血病和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NH）的分型方面。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢查是診斷白血病的基礎(chǔ)，但有局限性。當(dāng)遇到形態(tài)學(xué)難以診斷的白血病，只有靠免疫分型來(lái)輔助診斷。目前白血病免疫分型主要用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行以下檢測(cè)：（1）急性淋巴細(xì)胞性白血?。╝cute lymphoblastic leukem ia，ALL）的類型及分化階段；（2）急性髓細(xì)胞性白血病（acutemyelocytic leukem ia，AML）的亞型；（3）診斷急性未分化白血病、一些少見(jiàn)類型白血病和混合型白血??；（4）指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后等［25－26］。在臨床上，T淋巴細(xì)胞亞群分析對(duì)于腫瘤患者免疫功能的監(jiān)測(cè)具有重要的意義［27］。流式細(xì)胞術(shù)可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞狀態(tài)的監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)估療效，從而調(diào)整治療方案［28］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤耐藥性和復(fù)發(fā)的根源［29］。流式細(xì)胞術(shù)還可以通過(guò)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的特殊標(biāo)記，將腫瘤干細(xì)胞分選出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行研究，以達(dá)到徹底治愈腫瘤的目的［30］。

5.2 PCR-反向點(diǎn)雜交法（PCR-reverse dot hybridization，PCR-RDH）

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與載有特定序列探針的膜條進(jìn)行雜交以顯示出結(jié)果?？捎糜跈z測(cè)HPV，對(duì)宮頸樣本、陰道分泌物、其他新鮮或石蠟活檢樣本，通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA提取、PCR、雜交幾個(gè)步驟，就能在膜條上對(duì)HPV分型。目前市場(chǎng)上有HPV 28型檢測(cè)試劑盒，能檢出15種高危型、3種疑似高危型和10種低危型。

5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）

此方法利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，用熒光信號(hào)的強(qiáng)度定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物，即模板DNA的拷貝數(shù)，在分子病理學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。如檢測(cè)結(jié)核桿菌等病原菌，能檢出最低103個(gè)拷貝數(shù)／m L，比傳統(tǒng)的特殊染色的檢出率提高很多。還有對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell long cancer，NSCLC）的間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因［31－32］用RT-PCR方法檢測(cè)，相對(duì)于FISH法來(lái)說(shuō)，靈敏度更高，結(jié)果判斷更為客觀；缺點(diǎn)是樣本中RNA易降解，且易污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求高［33］。RT-PCR也常用于對(duì)其他病原菌如肝炎病毒等的檢測(cè)［34－35］。

6 小結(jié)與展望

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個(gè)體化治療和靶向用藥是未來(lái)醫(yī)療的必然趨勢(shì)，而這均建立在對(duì)患者進(jìn)行全面檢測(cè)的基礎(chǔ)上，如用免疫組化檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平，用原位雜交和基因突變檢測(cè)分析細(xì)胞中核酸的含量及改變，用生物芯片來(lái)進(jìn)行規(guī)?；姆治龊捅葘?duì)等等。隨著醫(yī)療水平的提高和各種新技術(shù)的應(yīng)用，分子病理學(xué)必將在未來(lái)的醫(yī)療領(lǐng)域里扮演越來(lái)越重要的角色。

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The application ofmolecular pathological technology in the diagnosis and treatment of tumors

DONG He,SUN Qing★
(Department of Pathology,Qianfoshɑn Hospitɑl A ffiliɑted to Shɑndong University,Jinan,Shandong,China, 250014)

In recent decades,the development of molecular pathology has deepen people’s know ledge of disease and tumor from the level of organ,tissue,cell to the level of protein,chromosome and DNA.Themolecular pathological technology has greatly promoted the development ofmodern pathology by providing more precisive and objective evidence to guide the target therapy and prognosis of tumors.Molecular pathological technology has been w idely applied,such as immunohistochemistry,in situ hybridization,gene mutation detection,biochips,flow cytometry and so on.The molecular pathology w ill play amore and more important role in the futuremedical treatment.Here we summarize the application of molecular pathology technology in recent years in the diagnosis and treatment of tumors.

Molecular pathological technology；Diagnosis and treatment of tumors

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272420）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2011GSF11838）；山東自然科學(xué)基金（2R2012HM 085）；濟(jì)南市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201202039）

山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院病理科，山東，濟(jì)南250014

★通訊作者：孫青，E-mail：qingsw99＠163.com