兩例短串聯重復序列三帶型等位基因的遺傳多態性分析

許澤輝嚴提珍羅世強王秋華唐寧★

·論著·

兩例短串聯重復序列三帶型等位基因的遺傳多態性分析

許澤輝1，2嚴提珍1，2羅世強1，2王秋華1，2唐寧1，2★

目的本文分析親子鑒定常用STR基因座的三帶型等位基因特點。方法用Chelex法提取3 600例親子鑒定檢案（含8 734個個體）血液中的基因組DNA，利用美國ABI公司Amp FISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒進行復合熒光PCR擴增確定STR基因座的遺傳圖譜（ABI 3500Dx遺傳分析儀），若出現異常峰型則采用PowerPlex?21系統進行復查驗證和采用Yunis技術進行淋巴細胞染色體核型分析。結果2個檢案分別在D18S51和FGA基因座上出現三帶型等位基因現象（均屬于Ⅰ型），總檢出率為0.229‰（2／8 734），攜帶三帶型等位基因的個體經染色體核型分析均未發現三體綜合征。結論三帶型等位基因結果較少見，判讀須慎重，應采用不同試劑盒進行驗證以獲得準確分型。

短串聯重復序列；三帶型等位基因；遺傳多態性

短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）是一類存在于真核生物基因組中以2～6個堿基對為核心單位串聯重復排列而成的DNA序列。由于STR基因座的高度遺傳多態性和其在基因傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳規律等特點，PCRSTR復合擴增熒光檢測技術成為國際法醫學界不可或缺的一項重要技術手段，目前被廣泛應用于群體遺傳學、親權關系鑒定、罪犯識別、疾病分析等方面。正常情況下，任何一個STR基因座均表現為兩個等位基因（一個為父源性，另一個為母源性），經PCR擴增和電泳分析后，純合子個體的圖譜只表現為單一條帶或單個基因峰，雜合子個體則表現為兩條帶或兩個基因峰，不會出現三帶型或三個基因峰的現象。Crouse等［1］首次于1999年報道了三等位基因（tri-allelic pattern）或三帶型等位基因（three-banded allele pattern）現象。根據各個等位基因的相對熒光強度可把三帶型等位基因分為兩種類型：一種是熒光強度低的兩個“小峰”的峰高、峰面積之和等于熒光強度高的主峰的峰高、峰面積（Ⅰ型）；另一種是3個峰的峰高、峰面積接近相等（Ⅱ型）［2］。隨著PCR-STR復合擴增熒光檢測技術的發展，世界各個法醫鑒定實驗室或鑒定機構接待的案例越來越多，三帶型等位基因陸續被報道。截至2014年12月10日，三帶型等位基因在13個核心STR基因座（TPOX、CSF1PO、FGA、TH01、vWA、D3S1358、D5S818、D8S1179、D7S820、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11）中已報道了247例，其中以D18S51和FGA基因座的頻率最高，分別為38種和37種，vWA和D21S11基因座則均有24種［3］。本文通過大樣本分析，對三帶型等位基因的特點和產生原因進行了探討，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集2012年8月到2014年8月柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室親子鑒定檢案3 600例（包括8 734個中國人群個體），檢材為人體血樣、帶毛囊毛發、羊水、組織等。

1.2 方法

1.2.1 Chelex-100法提取血斑DNA

按照文獻［4］報道采用Chelex-100法提取血斑DNA。剪取受檢樣本約0.5 cm2的血斑，加到0.5 m L的離心管中，加入500μL純水，劇烈振蕩，室溫下放置15m in。13 000 rpm離心3m in，去上清，收集沉淀。在沉淀中加入200μL 5％Chelex-100溶液，在振蕩器上反復振蕩，放入56℃保溫30 m in以上。取出后振蕩，100℃保溫8m in，振蕩后13 000 rpm離心3 min，上清用于PCR擴增，或放4℃保存備用。

1.2.2 復合熒光擴增和毛細管電泳檢測

運用美國ABI公司AmpFISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒（包括16個STR位點：CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、TH01、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、D5S818、FGA和Amelogenin）進行復合熒光PCR擴增，若發現出現異常峰型則采用PowerPlex?21系統（包括20個STR位點和1個性別位點：D1S1656、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、Amelogenin、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA）進行復查驗證，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。在美國ABI公司3500Dx遺傳分析儀上進行熒光檢測分析，最后采用GeneMapper ID-X-V1.4軟件進行數據分析。

1.2.3 染色體核型分析

外周血細胞染色體核型分析采用淋巴細胞培養，常規步驟制備染色體，G顯帶，鏡下計數和分析核型。嚴格按照SOP文件進行操作［5］。

2 結果

2.1 D18S51和FGA基因座毛細管電泳結果

檢測3 600個檢案的血濾紙樣本，結果發現2例親子鑒定的個案中出現了三帶型等位基因。2例三帶型等位基因結果見表1。利用Amp FISTRR? IdentifilerTMplus試劑盒對2個檢案的父親、母親和孩子的血樣DNA進行16個STR位點檢測，其中D18S51和FGA基因座的毛細管電泳檢測結果見圖1。個案1母親和個案2孩子的DNA樣品用PowerPlex?21系統重復驗證，進行21個STR位點檢測，其中D18S51基因座的毛細管電泳結果見圖2。與圖1比較可見，個案1母親的D18S51基因座結果一致，都檢出17／18／19三個等位基因，

其信號強度、峰高和峰面積之比約等于2∶1∶1，其中，等位基因19遺傳給了孩子；個案2孩子的FGA基因座結果也一致，均檢出22／23／26三個等位基因，其信號強度、峰高和峰面積之比約等于1∶1∶2，其中23等位基因來自父親，26等位基因來自母親，22等位基因在雙親均未發現。

2.2 染色體核型分析結果

對2個攜帶三帶型等位基因的個體進行了外周血淋巴細胞染色體核型分析，檢案1母親的核型為46，XX，檢案2孩子的核型為46，XY，均未見染色體數目和結構明顯異常。結果表明這2個個體未見染色體畸變現象（圖3）。

表1 親子鑒定中三帶型等位基因的遺傳分析Table 1 Genetic analysis of three-banded allele patterns in paternity testing

圖1 Ⅰ型三帶型等位基因攜帶者的親子鑒定圖譜Figure 1 STR profiles of paternity testing with the three-banded allele pattern of TypeⅠ

3 討論

STR是國內外法醫學親子鑒定和個體識別的主要方法，其適用于各種來源的生物性檢材，具有靈敏度高、個體識別機率和非父排除率高、PCR檢測所需檢材量少等優點。STR主要是在DNA復制

過程中滑動，或復制和修復時滑動鏈與互補鏈堿基錯配，引起一個或幾個重復單位的缺失或插入而形成。單個STR基因座的PCR擴增，其圖譜一般是雜合子個體有2個峰或2條帶，而純合子個體則只有1個峰或1條帶，正常情況下不會出現3個峰或3條帶。但是，在STR的應用過程中發現了一些個體的STR基因座出現3個峰或3條帶（即三帶型等位基因）。據STRbase的相關統計，目前已報道三帶型等位基因有363種，其中13個核心STR基因座共247種，其它常見STR基因座（包括D2S1338、D19S433、Penta D、Penta E、FES／FPS、 SE33、D10S1248和D12S391）共52種，Y染色體STR基因座共64種［3］。

圖2 D18S51和FGA基因座三等位基因圖譜（PowerPlex?21 system）Figure 2 Three-banded allele patterns observed at locus D18S51and FGA（PowerPlex?21 system）

圖3 三帶型等位基因攜帶者的淋巴細胞染色體核型分析結果Figure 3 The results of karyotype analysis of the lymphocytes from the three-banded allele pattern carriers

國內研究顯示三帶型等位基因在中國人群的檢出率很低（檢出總頻率為0.721‰），不同基因座的三等型等位基因檢出率存在差異，以D21S11、D18S51和FGA基因座的檢出率較高，檢出率分別為0.172‰、0.137‰和0.103‰［6］。本研究在D18S51和FGA基因組上檢出三帶型等位基因，檢出率為0.114‰（1／8734），這與其他大樣本的三帶型等位基因研究結果一致［6－7］。研究者發現不同STR基因座三帶型等位基因的類型分布不同，他們的分

析結果表明D8S1179基因座三帶型等位基因以Ⅱ型為主（占35％），Ⅰ型占7％；D18S51基因座三帶型等位基因則以Ⅰ型為主（為33％），Ⅱ型為12％；同時提出體細胞突變可能是Ⅰ型三帶型等位基因的形成的主要原因，而染色體重組或生殖細胞中染色體片段的局部重復可導致Ⅱ型三帶型等位基因的形成［2］。本研究在3 600例親子鑒定（包括8 734個個體）案件中發現了2例Ⅰ型三帶型等位基因，峰高較低的兩個等位基因均只相差一個核心重復序列，推測可能是原本為雜合子的兩個等位基因在個體發育過程中，其中一個等位基因發生了一步滑動錯配，從而產生新的等位基因［2，8］。我們重復提取DNA，按不同試劑盒說明書進行PCR擴增（Amp FISTRR?IdentifilerTMplus試劑盒和PowerPlex?21系統）、毛細管電泳、分析，其檢測結果相吻合，提示檢出的三帶型等位基因不是PCR擴增引起的非特異產物，也不是實驗室的污染或電泳時泳道滲漏造成的假象。

目前關于三帶型等位基因產生的機制尚不太清楚，研究者們［2，9-10］認為可能的機制主要體現在以下幾個方面：（1）在減數分裂時父系或母系同源染色體不分離而整體遺傳給子代，即出現三多倍體現象。三帶型等位基因的出現在染色體畸形導致的三體綜合征時比較常見，但是在正常人群中出現頻率較低，本文案例1的母親D18S51基因座出現了17／18／19三帶型等位基因，其余STR位點正常，懷疑該母親患有18三體綜合征，雖然該病患者壽命一般很短，但是也有報道發現成年人18三體病例。我們對該母親外周血進行細胞染色體核型分析后發現，18號染色體并未增多，可見該母親在18號染色體上出現的三帶型等位基因并非由于父系或母系同源染色體在減數分裂時不分離而整體遺傳給子代而造成的。（2）同源染色體在減數分裂時出現不等價交換導致等位基因重復。個體發生易位（translocation），染色體或某些位點有重復均可影響STR的分型結果。如果重復伴隨有核心重復序列的缺失或插入，可形成三條帶的帶型。（3）在受精卵發育過程中染色體不分離產生不同基因型細胞組成的嵌合體（由兩種或多種不同染色體核型的細胞組成），在PCR-STR分型時也可形成三帶型等位基因。（4）STR的不穩定性與許多腫瘤有關，包括肺癌、消化道腫瘤、前列腺癌、婦科腫瘤、腎腫瘤和白血病等。發生腫瘤病變的組織或細胞，可以在一些STR位點檢出三條或三條以上的帶。（5）骨髓移植或臍血移植受者體內有供者的細胞生長，這些特殊個體在PCR-STR分型中，可以檢出有多條帶，或不同組織檢出不同的基因型。

近幾年來關于三帶型等位基因是如何遺傳給后代的課題已成為新的研究熱點。2008年Vidal等［11］通過三代5個家庭成員的家系分析發現孫女D3S1358基因座三帶型等位基因來源于其祖母。土耳其一對近親結婚（哥哥和妹妹）的夫婦，他們均為三帶型等位基因攜帶者（攜帶16／17／18等位基因），生下了一個四等位基因（17和18等位基因均為雙拷貝）的孩子［12］。巴西里約熱內盧天主教大學研究團隊采集了一個四代45個家庭成員的大家系，發現6名女性成員攜帶TPOX基因座的三帶型等位基因（屬于Ⅱ型），核型結果顯示2號染色體短臂未見部分三體。攜帶者的基因型均為8／10／11，推測攜帶者所有細胞的TPOX基因座序列為三拷貝，10等位基因為TPOX基因座的額外形成的第三個等位基因，因其距離TPOX基因座較遠，推測10等位基因可能與Xq存在連鎖關系［13］。2014年國內學者提出Ⅰ型三帶型攜帶者隨機傳遞一個等位基因給子代，Ⅱ型攜帶者可遺傳兩個等位基因給子代［6］。在本文的2例檢案中，檢案1雖然沒有遺傳給后代，但特別值得一提。母親的17等位基因的峰面積約等于18、19等位基因峰面積的總和，提示等位基因17可能有兩個拷貝，它的基因型可能是17／18和17／19，在減數分裂時，染色體分離并將其中一條傳給子代，但子代中并沒有出現17／19等位基因，只有19等位基因傳給了子代。檢案2的三帶型等位基因只發現于孩子中，父母均正常，無法了解是否會遺傳。本研究檢出三帶型等位基因例數較少，并且僅觀察了兩代的遺傳情況，進行多代研究和積累更多的案例是后續研究的方向。目前對于親子鑒定案件涉及的三帶型STR基因座尚無統一的親權指數（paternity index，PI）計算方法［14］，一般將親代傳給子代的兩個等位基因視為整體進行計算［15］。

綜上所述，在親子鑒定檢案中三帶型等位基因現象極為少見，容易被忽視。因此，在PCR-STR

分型時出現此現象需引起重視。若發現可疑三帶型等位基因，需要進行重復試驗（包括標本提取、PCR擴增和電泳分析等全過程），排除泳道滲漏或者模板污染等問題；同時采用其他試劑盒或方法相互驗證結果以免發生誤判，保證鑒定結論的準確性、可靠性和科學性。

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Genetic polymorphism analysis of two short tandem repeat three-banded allele patterns

XU Zehui1,2,YAN Tizhen1,2,LUO Shiqiang1,2,WANG Qiuhua1,2,TANG Ning1,2★
(1.Department of Clinical Laboratory,Liuzhou Maternal and Child Care Hospital,Liuzhou,Guangxi,China, 545001；2.Liuzhou Key Laboratory of Birth Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi,China, 545001)

Objective To analyze t he characteristics of three-banded alleles patterns.Methods Genom ic DNA was extracted from blood samples of 3 600 paternity cases(including 8 734 individuals)by using Chelex method.Genetic profiles of STR loci were determ ined by multiplex fluorescence PCR amplification w ith the Amp FISTRR?IdentifilerTMplus kit(ABI,America).Re-analysis was performed by using the PowerPlex?21 system,and the karyotype of lymphocytes was analysed by Yunis'technique.

Short tandem repeat；Three-banded allele pattern；Genetic polymorphism

柳州市科學研究與技術開發計劃項目（2014G020404）

1.柳州市婦幼保健院檢驗科，廣西，柳州545001 2.柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室，廣西，柳州545001

★通訊作者：唐寧，E-mail：tn825＠126.com

注：許澤輝，嚴提珍為并列第一作者

Results 2 Type1 three-banded allele patterns at D18S51 and FGA loci were observed.The frequency for tri-allelic patterns in autosomal STRs was 0.229‰.Karyotype analysis showed no occurrence of trisomy w ith the three-banded patterns carriers.Conclusion Three-banded allele pattern events are extremely rare in paternity cases which need to be carefully assessed,and different amplification kit should be used to validate the results to obtain accurate genotyping.