胃癌的液相活檢

摘要：本文通過系統(tǒng)回顧外周血循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)細胞外核酸在胃癌早期診斷、預后評估、治療監(jiān)測中的作用，闡述其作為新型生物標記物的可能性，介紹胃癌液相活檢的概念由來和其潛在的臨床應用價值。

收稿日期：2015-05-11

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA021103）

作者簡介：王達，八年制博士，E-mail: wangda.0618@aliyun.com

通信作者：李國新，博士，主任，教授，博士生導師，電話：020-61641682，E-mail: gzliguoxin@163.com

Liquid biopsy of gastric cancer

WANG Da, LI Tingting, LEI Shangtong, LIU Hao, LI Guoxin

Department of General Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Abstract: The literature concerning the role of circulating tumor cells and cell- free nucleic acids in gastric cancer were systematically reviewed with respect to early diagnosis, prognosis evaluation and therapy monitoring. Both of them considered as candicates were explored to be potential biomarkers. Herein, we introduced the origin of the novel concept, liquid biopsy of gastric cancer, and possibility of their clinical application in therapeutic management of cancer patients.

Key words: gastric cancer; liquid biopsy; circulating tumor cells; cell-free nucleic acids

胃癌是世界上是第4大最常見的癌癥，占癌癥相關死亡第2位 ［1］。盡管近些年來診斷技術和圍手術期管理等方面得到很大改進，但胃癌的控制形勢依然不容樂觀，在胃癌死亡率沒有明顯下降的情況下，每年全球新發(fā)胃癌病例近90萬例 ［1］。這主要與以下幾個方面因素相關，一是缺乏行之有效進行早期診斷的方法；二是缺乏科學系統(tǒng)的預后評價指標；三是進展期胃癌手術或化療治療充分性存在不足；四是胃癌的發(fā)生發(fā)展機制及其產生耐藥的原理尚不清楚。因此，為了改善胃癌患者的臨床結局，早期發(fā)現和準確監(jiān)測疾病發(fā)生進展是十分必要的。

許多遺傳和表觀遺傳學的改變促進了腫瘤的發(fā)生、進展，越來越多的研究發(fā)現這些變化能夠用于診斷胃癌在內的惡性腫瘤，并能評估其預后，或者作為制定治療方案的依據 [2,3]。通常，對于實體腫瘤來說，只有手術活檢標本才可用于檢測腫瘤相關的分子水平上的改變，但傳統(tǒng)的組織活檢病理有諸多限制：（1）單處取材無法體現異質性；（2）單次活檢無法實現動態(tài)監(jiān)測；（3）活檢本身創(chuàng)傷大并容易致播散。所以，如能開發(fā)一種非侵入式的檢測方法在血液中獲取生物標記物，能夠實時監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展并能反饋藥物治療反應意義重大，可以有效克服上述傳統(tǒng)方法的缺點?；诖讼敕?，“液相活檢”這個概念應運而生，而循環(huán)腫瘤細胞（CTC）和細胞外游離核酸（cfNA）的發(fā)現使之從理想變?yōu)楝F實創(chuàng)造了條件 ［2，4］。本文就CTC、cfNA與胃癌的最新研究進展作一綜述。

1　循環(huán)腫瘤細胞與胃癌

1.1循環(huán)腫瘤細胞的發(fā)現與檢測

自Ashworth在1869年第1次發(fā)現CTC以來，對CTC的關注從未間斷，研究者們在不同實體腫瘤患者的血液中驗證CTC的存在 [5]。早期，由于技術瓶頸，從外周血中精確檢測極低濃度的CTC是一個巨大挑戰(zhàn)。近些年來，隨著技術發(fā)展，CTC的分離富集問題迎刃而解，目前主流方法有物理法和免疫學兩種。前者主要根據CTC大小、密度、電荷、遷移變形能力等進行分篩 [6-7]；后者則通過CTC表面攜帶的特定結合位點進行抗原抗體反應來進行獲取 ［8-9］，所獲得的CTC可以通過（熒光定量）PCR、FISH、標記抗原識別等技術手段進行鑒定。目前這兩種方法都能在集成系統(tǒng)中實現，為后續(xù)的CTC相關研究創(chuàng)造可能 ［10-11］。

1.2循環(huán)腫瘤細胞在胃癌研究中的作用1.2.1利用循環(huán)腫瘤細胞尋找胃癌易感基因獲得CTC后，RT-PCR一度成為主要研究手段，用以發(fā)現易感基因及其生物學功能。至今為止，與胃癌涉及緊密的主要有人端粒酶反轉錄酶（hTERT),細胞角蛋白(CK)家族, CEA和黏蛋白1（MUC1）等 ［12-14］。但其固有的高假陽性率限制了該領域的進一步發(fā)展，直到引入定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）后有了起色。但Wu等人 ［14］并不滿足于此，他們發(fā)明了一種高通量比色膜陣列，能夠同時檢測四種標記物，可較為敏感地預測胃癌患者的總生存率和術后復發(fā)轉移率。最近，非編碼RNA比如microRNA（miRNA）和Piwi-interacting RNAs（piRNA）等被證實在腫瘤發(fā)生進展中表達異常，這一特異性改變有望成為胃癌CTC檢測的突破 ［15-16］。然而，這種從外周血單個核細胞獲取的總RNA卻不能排除源于白細胞的RNA的干擾而純粹真實地反應CTC中miRNA。當然，這也同樣困擾著外周血細胞外游離miRNA的檢測。如何減少雜質RNA的影響，可能要從尋找更為敏感確切的特異性miRNAs和piRNA入手，只有這樣才能更符合轉化醫(yī)學的需要。

1.2.2利用循環(huán)腫瘤細胞監(jiān)測胃癌　腫瘤的復發(fā)、轉移與不良臨床預后關系緊密，并嚴重影響胃癌患者的生活質量。近來，不斷有研究提示CTC本身即可作為臨床預后指標。Hiraiwa等 ［17］利用CellSearch System發(fā)現外周血中CTC≥2組總生存率顯著低于CTC<2組；Matsusaka等 ［18］人則發(fā)現CTC≥4組的化療病人總生存期和無進展生存期要顯著小于CTC<4組，這一發(fā)現啟示我們，CTC水平也許與化療藥物治療反應相關。還有研究者將圍手術期的胃癌病人外周血CTC水平進行了動態(tài)監(jiān)測，結果發(fā)現術后CTC水平較術前明顯降低，有趣的是，部分研究提示術中CTC水平會有所增加，盡管這一現象尚有爭議，但至少說明一點，CTC可能作為監(jiān)測腫瘤動態(tài)變化的生物標記物 ［19］。

CTC所攜帶的基因、蛋白亦被認為潛在的預測指標。不少研究提示CEA、CK系列等標記物的mRNA水平與胃癌的總生存期、無進展生存期等相關 ［12, 20-21］。其中，值得注意的是，Mimori等 ［22］利用基因芯片技術篩選得到膜基質金屬蛋白酶1（MT1-MMP）基因，通過qRTPCR檢測MT1-MMP mRNA水平發(fā)現其為胃癌復發(fā)、轉移的獨立危險因素，這是目前臨床樣本量最大的研究之一。

目前CTC在胃癌領域的相關研究已有彌足進步，是具備巨大開發(fā)前景的潛在胃癌標記物。但是，我們對于外周血中這一類細胞的生物學特性尚知之甚少，是下一步研究攻克的方向，以便更好地理解其在胃癌進展和耐藥發(fā)生過程中的生物學行為。

2　細胞外游離核酸與胃癌

2.1細胞外游離核酸的發(fā)現與檢測

細胞外游離核酸(cfNAs)包括DNA、RNA、microRNA等組成。細胞外游離核酸最早由Mandel和Metais 于1948年在血漿中發(fā)現，卻直到1977年由Leon等 [4]人報道在腫瘤患者血清中發(fā)現細胞外游離脫氧核酸（cfDNA）才受到重視。1989年Vasioukhin等 ［23］首次證實腫瘤組織能夠釋放DNA至外周血中，這一假設被后續(xù)的NRAS和KRAS基因研究所佐證 ［24］。隨后RNA、miRNA相繼在外周血中被發(fā)現。關于細胞外游離核酸的來源目前有被動和主動釋放兩種主要學說，前者認為，細胞外游離核酸主要來源于凋亡或壞死的細胞；后者可能的解釋為，腫瘤細胞通過釋放DNA入血，由遠處的特定的靶細胞負責接收，這也許是腫瘤轉移可能的發(fā)生機制，目前尚缺乏足夠證據支持 ［25-27］。還有人推測細胞外游離核酸來源于CTC，但兩者數量級別并不對等，因而爭議頗多 ［2, 28］。因為細胞外游離核酸在血漿或血清中存在，故檢出手段并無特殊。

2.2細胞外游離核酸在胃癌研究中的作用

2.2.1利用細胞外游離DNA監(jiān)測胃癌細胞外游離DNA在腫瘤領域的研究由來已久，主要涉及到腫瘤相關的基因或表觀遺傳學的改變，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、雜合度消失、基因多態(tài)性、定點突變、基因甲基化、染色體缺失轉位和基因片段縮短等方面。目前研究較為成熟的經典案例，如外周血中的細胞外游離DNA中的KRAS基因突變與結直腸癌抗EGFR單抗藥物獲得性耐藥之間的聯(lián)系緊密 ［29］，在此基礎上，Misale等 ［30］發(fā)現能在西妥昔單抗治療的腫瘤病人中檢出血液KRAS基因等位基因突變，而根據這一結果能早于影像學檢查約10個月得出耐藥結論。此發(fā)現提示我們外周血細胞外游離DNA是潛在的腫瘤特異性標記物，可為腫瘤綜合治療個體化方案提供依據。

利用細胞外游離DNA檢測胃癌的研究亦有較大進展，其中除了將細胞外游離DNA總量、外周血管家基因、非編碼基因組DNA水平改變做為檢測指標外，值得注意的是，DNA甲基化研究領域突破最大。自Lee等 ［31］在2002年首次報道死亡相關蛋白激酶,鈣黏蛋白E-cadherin，谷胱甘肽轉硫酶pi基因1（GSTP1），p15 and p16 DNA甲基化水平能夠有效預測胃癌以來，甲基化CpG島微陣列技術等新手段的出現為尋找更為可靠的目標基因奠定了基礎。目前，XAF1基因DNA甲基化最受矚目，Ling等 ［32］證實其為胃癌預后的較好指標，敏感度和特異度分別為69.8%和100%。而在傳統(tǒng)的腫瘤特異性基因檢測領域，外周血MYC被Park團隊 ［33］證實與胃癌標本中的相同基因的變化趨勢一致，而在HER-2 ++ 或+++的胃癌病人中外周血HER-2水平與組織標本中變化趨勢不一致 ［34］。爭議伴隨著進步，這方面研究尚屬起步階段，未來將有新的證據來闡釋這些矛盾。

2.2.2利用細胞外游離RNA監(jiān)測胃癌起初，RNA因容易降解而不可避免地會丟失一些信息，故其在外周血檢測時是否能夠準確反映腫瘤發(fā)展遭受質疑。科學家們一度曾把目光轉向外周血RNA酶的檢測，但并未有很大突破。1999年，人們開始發(fā)現外周血中相對穩(wěn)定存在的RNA，一部分以蛋白脂質形式存在，另一部分則以小分子RNA形式存在 ［35-36］?？茖W家們首先在鼻咽癌患者血液中發(fā)現一種EB病毒相關的RNA，能夠特異性地反應腫瘤相關臨床特征 ［36］。隨后，MUC1、CXCR4等基因的mRNA相繼被報道與胃癌進展相關 ［37］。之后，Kang等 ［38］證實外周血hTERT mRNA的變化可作為胃癌診斷預后檢測的潛在標記物。

目前，這些RNA穩(wěn)定存在的機制尚不明確，當下廣為接受的主流假說是囊泡分泌學說 ［39］。即便產生的方式尚完全不為人所知，外周血細胞外游離RNA已成為腫瘤領域的研究熱點，而其中的miRNA更是炙手可熱的話題。

2.2.3利用細胞外游離miRNA監(jiān)測胃癌miRNA是一種由小片段核酸組成非編碼RNA，能通過抑制mRNA穩(wěn)定性和翻譯過程實現基因轉錄后調控。大量研究證實miRNA在細胞增殖、分化、凋亡、上皮間質化（EMT）、腫瘤轉移等領域發(fā)揮重要作用。自2008年以來，聚焦于外周血miRNA與惡性腫瘤之間關系的研究呈現井噴式爆發(fā)，相關的技術手段亦隨之得到長足進步，目前已開始向高通量集成方向發(fā)展。2010年，Tsujiura等 ［40］首次報道外周血miRNA (miR-17-5p, miR-21, miR-106a, miR-106b and let-7a)可能成為胃癌新的腫瘤標記物。此后，近30種miRNA先后被發(fā)現在胃癌的不同階段表達異常，均提示著其作為新生物標記物的可能性。然而，至今為止miRNA作為檢驗指標尚有幾個問題亟待解決：（1）如何消除個體差異；（2）如何篩選待檢的miRNA；（3）如何界定臨界值？這些問題部分來源于人體內復查的miRNA調控網絡，因為1個miRNA可調控多個mRNA，而特定mRNA又可由多個miRNA調控。為了克服這一缺陷，人們開發(fā)了miRNA基因組分析方法，并由此得到目前最有開發(fā)前景的兩個生物標記物miR-451和miR-486，各自在受試者工作特征曲線中的曲線下面積為0.96和0.92，提示胃癌預測準確性較高 ［41］。盡管如此，它們的有效性還需要大規(guī)模的臨床研究來驗證。

2.2.4利用細胞外游離lncRNA監(jiān)測胃癌長鏈非編碼RNA (lncRNA)由200個以上核酸序列組成，因為不含開放閱讀框而無法編碼蛋白，但卻能廣泛參與RNA加工過程，進而調控基因、影響染色體的修飾。lncRNA日益成為當下的研究新寵，在發(fā)育學和腫瘤學方面飽受關注。最近，Arita等 ［42］首次報道利用細胞外游離lncRNA監(jiān)測胃癌，研究發(fā)現胃癌患者外周血中l(wèi)ncRNA H19較正常人顯著升高，而在術后下降，提示H19是良好的診斷指標。雖然我們對lncRNA還知之甚少，隨著研究深入，相信會有更為喜人的突破。

3　結論

綜上所述，得益于技術手段的突飛猛進，使得利用外周血進行胃癌的“液相活檢”成為可能。無論是循環(huán)腫瘤細胞還是循環(huán)細胞外游離核酸，在胃癌領域的研究都尚處搖籃時期，但其潛在的實用價值已初見端倪。未來，將有大規(guī)模的臨床研究篩選得到切實有效的生物標記物，能夠用于胃癌的預測、診斷、評估和監(jiān)測，從實驗室到臨床的成功轉化最終使廣大胃癌患者受益。