生芪、連翹對中華絨螯蟹生長及健康指標(biāo)的影響

孫學(xué)亮　孫朦朦　季延斌　等

摘要：使用生芪、連翹與普通河蟹飼料混合制成中草藥飼料，分組飼喂，分別在試驗(yàn)開始后第2周、第4周取樣，測定試驗(yàn)組血清中與機(jī)體非特異免疫相關(guān)的重要酶類活性指標(biāo)的免疫保護(hù)率。結(jié)果表明，在飼料中添加生芪、連翹均對河蟹體內(nèi)的健康指標(biāo)產(chǎn)生了影響，生芪、連翹對SOD、CAT活力表現(xiàn)為促進(jìn)作用，同時(shí)NO、MDA含量降低，所有單方10%濃度效果均優(yōu)于0.5%濃度，說明使用效果隨著單方濃度的增加而增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；生芪；連翹

中圖分類號： S917.4；S963.73+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0224-03

收稿日期：2014-02-24

基金項(xiàng)目：國家星火計(jì)劃（編號：2013GA610002）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金（編號：20110621）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（編號：201101050）。

作者簡介：孫學(xué)亮（1984—），男，碩士，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail：sunxueliang1234@aliyun.com.cn。

通信作者：陳成勛，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E-mail：ccnxny@163.com。河蟹學(xué)名中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H.Milne-Edward），別稱河蟹、毛蟹、湖蟹、螃蟹、大閘蟹、清水蟹等，隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）軟甲亞綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）爬行亞目（Reptantia）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriochier）[1]。河蟹具有生長速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，近年來，我國河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，河蟹養(yǎng)殖業(yè)已成為我國的特色產(chǎn)業(yè)[2]。我國有5 000多種中藥資源可供開發(fā)利用。中草藥大多含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、微量元素、礦物質(zhì)、未知生長因子及各類生物活性物質(zhì)，具有增進(jìn)機(jī)體新陳代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)及酶的合成、增強(qiáng)水產(chǎn)動物免疫功能等作用[3]。中草藥作為混飼劑或飼料添加劑能夠滿足當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；a(chǎn)的需要，應(yīng)用中草藥防治水產(chǎn)動物疾病完全符合發(fā)展無公害水產(chǎn)業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的病害防治準(zhǔn)則[4-5]。本試驗(yàn)使用生芪、連翹與普通河蟹飼料混合制成中草藥飼料，分組飼喂，測定試驗(yàn)組血清中與機(jī)體非特異免疫相關(guān)的重要酶類活性指標(biāo)的免疫保護(hù)率，探討中草藥添加劑對于提高河蟹非特異免疫力的效果，旨在為推廣中草藥免疫增強(qiáng)劑提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)飼料202型河蟹專用商品飼料（浙江欣欣飼料股份有限公司嘉興大橋分公司）粗蛋白質(zhì)含量≥34.0%，粗脂肪含量≥3.0%，鈣含量1.0%～3.0%，總磷含量≥1.0%，將其粉碎后過80目篩，取細(xì)粉備用。將中草藥生芪、連翹（均購于安徽新興中藥飲片有限公司）用高速藥材調(diào)料粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，取細(xì)粉備用。將3種中草藥的細(xì)粉分別按0.5%、1.0%2個(gè)濃度梯度采用逐級混勻方法均勻混入上述已粉碎好的商品飼料中，制型后備用。

1.1.2試驗(yàn)用蟹試驗(yàn)用幼蟹取自天津市寧河縣七里海河蟹種業(yè)基地，平均體質(zhì)量為（0.35±0.02） g。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日常管理河蟹在箱內(nèi)暫養(yǎng)，投喂未添加中藥的飼料，箱中放入石塊提供攀爬與躲避場所。馴化7～10 d后，待河蟹攝食正常后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)按投喂飼料中含中草藥種類、劑量不同分為對照組、生芪組（Ⅰ0.5、Ⅰ1.0）、連翹組（Ⅱ0.5、Ⅱ1.0），每組設(shè)2個(gè)平行，每箱100只河蟹。試驗(yàn)期間每天投喂試驗(yàn)餌料2次，每次投喂量為河蟹體質(zhì)量的3%～5%，08：30投喂量占每天總投喂量的40%～50%，16：30 投喂量占每天總投喂量的50%～60%，視河蟹吃食情況適當(dāng)增減，及時(shí)清除殘留的飼料、幼蟹蛻皮物及死亡的幼蟹。每天15：00換1次曝氣1 d的自來水，每次換水量為箱中水量的1/3～1/2（視水質(zhì)情況而定），養(yǎng)殖過程中保持連續(xù)充氣，水溫控制在24～28 ℃。試驗(yàn)期內(nèi)不施用任何藥物，保證試驗(yàn)結(jié)果不發(fā)生偏差。試驗(yàn)周期為30 d，分別在試驗(yàn)期內(nèi)第2周、第4周進(jìn)行采樣，采樣時(shí)每箱隨機(jī)抽取30只河蟹。

1.2.2樣品制備由于幼蟹個(gè)體小，去外殼易黏連內(nèi)臟組織，對數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，幼蟹外殼主要成分是CaCO3，所以將蟹體整體磨碎制作組織勻漿。將蟹用蒸餾水漂洗2次，撈出并濾干，放在0 ℃含冰水的解剖盤內(nèi)，逐個(gè)沿基部剪去蟹體所有步足，放入封口袋中并標(biāo)記，貯存于-20 ℃冰箱中，進(jìn)行組織勻漿之前，取蟹體在冷生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，稱質(zhì)量，均勻平鋪在冰浴的5 mL小燒杯內(nèi)，蟹體之間盡量不堆疊。用移液管量取0.86%冷生理鹽水。先向燒杯中加入可以淹沒小蟹的生理鹽水量，再用干凈已消毒的眼科小剪盡快剪碎組織塊，最后用余下的生理鹽水分2次沖洗剪刀，以保證剪刀上無殘留。將組織移入 1 mL Eppendorf管中，標(biāo)號，用SCIENTZ-192高通量組織研磨器充分勻漿，制成10%組織勻漿，取適量組織勻漿制作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀察細(xì)胞是否磨破，若沒有破則可延長勻漿時(shí)間或增加凍溶次數(shù)（此步可省略）。用5840R高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min 4 ℃離心30 min，吸取上清液置于1 mL Eppendorf管中，標(biāo)號。將所得上清液在同樣的條件下再離心1次，吸出上清液置于 1 mL Eppendorf管中，根據(jù)試驗(yàn)需要，取適量上清液進(jìn)行測定，并于24 h內(nèi)分析完畢。

1.3抗氧化指標(biāo)的測定

試驗(yàn)中各組織總超氧化物歧化酶（T-SOD）含量、過氧化氫酶（CAT）含量、丙二醛（MDA）含量、NO含量等指標(biāo)均采用南京建成生物工程技術(shù)研究所提供的試劑盒測定。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1生芪對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由表1可知，第2周Ⅰ1.0組與Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性差異不顯著，Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照組相比差異不顯著，Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)SOD活性顯著高于對照組（P<0.05）。第4周3組之間河蟹體內(nèi)SOD活性均無顯著差異，Ⅰ1.0組活性最大，對照組活力最小。

表1生芪對河蟹體內(nèi)SOD活性的影響

處理SOD活性（U/mg）第2周第4周對照組86.49±1.75b103.19±1.75aⅠ0.5組94.74±3.32ab108.44±3.42aⅠ1.0組98.67±2.77a110.02±1.52a注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表2至表8同。

2.2連翹對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由表2可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照組相比差異顯著（P<0.05），Ⅱ1.0組與對照組差異不顯著，Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著。Ⅱ1.0組SOD活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最小。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)SOD活性與對照差異不顯著，Ⅱ0.5組與對照差異顯著（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著，Ⅱ1.0組活性最大，對照組最小。

表2連翹對河蟹SOD活性的影響

處理SOD活性（U/mg）第2周第4周對照組86.49±1.75b103.19±1.75bⅡ0.5組93.42±8.53a108.11±8.44aⅡ1.0組99.33±6.36ab113.06±6.27ab

2.3生芪對河蟹體內(nèi)過氧化氫酶（CAT） 活性的影響

由表3可知，第2周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組差異不顯著（P>0.05）。Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅰ0.5組次之，對照組最小。第4周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組無顯著差異（P>005）。Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅰ0.5組次之，對照組最小。

2.4連翹對河蟹體內(nèi)過氧化氫酶（CAT） 活性的影響

由表4可知，第2周Ⅱ0.5組、Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組差異不顯著

表3生芪對河蟹體內(nèi)CAT活性的影響

處理CAT活性（U/mg）第2周第4周對照組10.11±0.19b12.45±0.18bⅠ0.5組10.58±0.07a12.97±0.04aⅠ1.0組10.62±0.13a13.04±0.27a

（P>0.05）。Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最低。第4周Ⅱ0.5組、Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性均顯著高于對照組（P<0.05），Ⅱ0.5組與Ⅱ1.0組無顯著差異（P>0.05）。Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)CAT活性最大，Ⅱ0.5組次之，對照組最低。

表4連翹對河蟹體內(nèi)CAT活力的影響

處理CAT活性（U/mg）第2周第4周對照組10.11±0.19b12.45±0.19bⅡ0.5組10.57±0.06a13.02±0.09aⅡ1.0組10.66±0.15a13.11±0.35a

2.5生芪對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

由表5可知，第2周Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組及Ⅰ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅰ1.0組之間無顯著差異（P>0.05）。第4周Ⅰ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組、Ⅰ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅰ1.0組無顯著差異（P>0.05）。對照組MDA含量最高，Ⅰ0.5組最低。

表5生芪對河蟹體內(nèi)MDA含量的影響

處理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周對照組2.26±0.08b1.55±0.06bⅠ0.5組2.02±0.06a1.35±0.09aⅠ1.0組2.21±0.10b1.52±0.13b

2.6連翹對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

由表6可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著低于對照組、Ⅱ1.0組（P<0.05），對照組與Ⅱ1.0組之間無顯著差異（P>0.05）。對照組河蟹體內(nèi)MDA含量最高，Ⅱ0.5組最低。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)MDA含量顯著高于對照組、Ⅱ0.5組（P<0.05），對照組與Ⅱ0.5組無顯著差異（P>0.05）。Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)MDA含量最高，Ⅱ0.5組最低。

表6連翹對河蟹體內(nèi)MDA含量的影響

處理MDA含量（nmol/mg）第2周第4周對照組2.26±0.08b1.55±0.06aⅡ0.5組2.15±0.07a1.53±0.06aⅡ1.0組2.24±0.11b1.78±0.10b

2.7生芪對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

由表7可知，第2周Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量均顯著低于對照組（P<0.05），Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量雖低于Ⅰ0.5組，但是二者間無顯著差異（P>0.05）。對照組河蟹體內(nèi)NO含量最高，Ⅰ0.5組次之，Ⅰ1.0組最低。第4周Ⅰ0.5組與Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量顯著低于對照組（P<0.05），Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量雖低于Ⅰ0.5組，但是二者間無顯著差異（P>0.05）。對照組NO含量最高，Ⅰ0.5組次之，Ⅰ1.0組最低。

表7生芪對河蟹體內(nèi)NO含量的影響

處理NO含量（μmol/L）第2周第4周對照組6.97±0.35b9.70±0.29bⅠ0.5組3.51±0.60a4.79±0.50aⅠ1.0組2.62±0.32a4.33±0.20a

2.8連翹對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

由表8可知，第2周Ⅱ0.5組河蟹體內(nèi)NO含量與對照組、Ⅱ1.0組差異不顯著（P>0.05），Ⅱ1.0組NO含量顯著低于對照組（P<0.05），對照組NO含量最大，Ⅱ0.5組次之，Ⅱ1.0組最小。第4周Ⅱ1.0組河蟹體內(nèi)的NO含量與Ⅱ0.5組差異不顯著（P>0.05），Ⅱ0.5組NO含量顯著低于對照組（P<0.05），對照組NO含量最大，Ⅱ0.5組次之，Ⅱ1.0組最低。

表8連翹對河蟹體內(nèi)NO含量的影響

處理NO含量（μmol/L）第2周第4周對照組6.97±0.35b9.70±0.29bⅡ0.5組5.55±0.46ab7.83±0.30aⅡ1.0組4.62±0.18a7.05±0.20a

3結(jié)論與討論

3.1生芪、連翹對河蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD具有抗菌、抗病毒等作用，可作為機(jī)體非特異性免疫指標(biāo)來評判免疫刺激劑對機(jī)體非特異性免疫力的影響[4-8]。過氧化氫酶是一種酶類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可清除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫，使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。本研究表明，生芪、連翹對中華絨螯蟹體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶活性（CAT）有促進(jìn)作用，且與添加劑量、作用時(shí)間有關(guān)。李明等研究認(rèn)為，中草藥（黃芪、板藍(lán)根、金銀花、生石膏）對凡納濱對蝦血清中SOD活性有顯著影響[9]。李廷友等研究認(rèn)為，在飼料中添加一定比例的枸杞、黃芪、茯苓等中藥能大幅提高中華絨螯蟹、扣蟹體內(nèi)SOD活性[10]。楊柳認(rèn)為，一定劑量的貫葉連翹能明顯延長小鼠常壓耐缺氧時(shí)間、增加SOD活力、CAT活力[11] 。

3.2生芪與連翹對河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

MDA含量能比較準(zhǔn)確地反映機(jī)體內(nèi)自由基的代謝情況及組織的氧化損傷情況，這對判斷機(jī)體的健康狀況以及免疫防御能力具有重要價(jià)值[12]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)丙二醛（MDA）含量均較對照組有所降低。陳會良等在肉雞飼料中添加中草藥添加劑，發(fā)現(xiàn)雞肉中MDA含量隨之降低[13]。陳雁南等認(rèn)為，在肉雞飼料中添加中草藥添加劑能有效提高肉雞抗氧化水平[14]。與公衍玲等用中藥提取物體外抗氧化活性研究得出的結(jié)論[15]相同。

3.3生芪與連翹對河蟹體內(nèi)一氧化氮（NO）含量的影響

NO起著信使分子的作用，也能在神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中發(fā)揮作用。免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO分子不僅能抗擊侵入人體的細(xì)菌、病毒等微生物，而且還能夠在一定程度上阻止癌細(xì)胞繁殖，阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散等[16-17]。本研究表明，投喂生芪4周后，Ⅰ0.5組、Ⅰ1.0組河蟹體內(nèi)NO含量均顯著低于對照組，說明生芪能降低河蟹體內(nèi)NO含量。這與韓永禧等[18]、楊長春等[19]的研究結(jié)果一致。在飼料中添加生芪、連翹均對河蟹體內(nèi)的健康指標(biāo)產(chǎn)生了影響，生芪、連翹對SOD、CAT活力表現(xiàn)為促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中所有單方1.0%濃度效果均優(yōu)于0.5%濃度，說明使用效果隨著單方濃度的增加而增強(qiáng)。

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