全自動細胞分選儀對單細胞篩選的優(yōu)化與應(yīng)用

張 芳, 李麗莉, 楊怡姝, 李勁濤, 盛 望, 李澤琳, 曾 毅

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124)

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全自動細胞分選儀對單細胞篩選的優(yōu)化與應(yīng)用

張 芳, 李麗莉, 楊怡姝, 李勁濤, 盛 望, 李澤琳, 曾 毅

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124)

以Ec-109、BHK細胞為例，采用AVISO細胞分選儀進行單細胞的分選與優(yōu)化。首先，將電腦中的細胞篩選軟件與顯微鏡相連接，依據(jù)不同的細胞類型，設(shè)置合適的挑選參數(shù)，并從X、Y與Z軸層面精確校準挑選位置。通過自由設(shè)定細胞特征參數(shù)，可準確地挑選到目標細胞。最后，檢測分析細胞篩選率，均可達到90%以上。該篩選技術(shù)對單細胞的挑選可提高到可視化水平，與常規(guī)篩選方法相比，樣品不需特殊處理，細胞收集方便，節(jié)約操作時間，提高了實驗效率。

全自動細胞分選儀； 細胞篩選； 特征參數(shù)

0 引 言

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，單細胞的研究逐漸受到關(guān)注。單細胞分析可以獲得反映細胞生理狀態(tài)和過程更準確、更全面的信息，對于研究細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生理病理和重大疾病的早期診斷十分重要[1-3]。然而，單細胞提取數(shù)量少，分析困難大，常用的篩選方法有流式細胞術(shù)(FCM)、高通量定向細胞篩選技術(shù)等[4-6]，但FCM篩選細胞需要數(shù)量多，篩選后僅獲得細胞群，而不是單一的細胞；常規(guī)的定向篩選是在96孔或384孔板中加抗生素，通過不斷的加壓篩選出有活性的細胞，該操作簡單，但工作量大、耗時長、容易產(chǎn)生假陽性[7-8]。因此，提高單細胞陽性篩選率勢在必行。

AVISO細胞分選儀是最新一代全自動單細胞分選、細胞群分離的自動化系統(tǒng)，能完整記錄細胞掃描及克隆挑選全過程，通過自由設(shè)定細胞特征參數(shù)(如形態(tài)學(xué)、熒光信號等)進行高通量單細胞篩選與分析。使用范圍廣，對貼壁細胞、懸浮細胞、干細胞以及組織等多種樣品均可使用。陽性細胞獲取率高，樣本細胞不需要處理，方便快速，特別適用于低細胞數(shù)量的篩選。將細胞培養(yǎng)、收集提高到一種高分辨可視、選擇性控制的全新水平，在細胞生物學(xué)、再生醫(yī)藥研發(fā)研究領(lǐng)域處于領(lǐng)先優(yōu)勢[9-11]。本文對AVISO細胞分選儀功能與應(yīng)用進行了探究，描述了系統(tǒng)分選細胞的整個過程，并以轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(EmGFP)的食管癌Ec-109細胞與感染痘苗病毒的BHK細胞為研究對象，觀察不同種細胞分選后單細胞陽性獲取率及細胞存活率。

1 實驗材料與儀器

(1) 材料。Ec-109細胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR203 vector)、BHK細胞(轉(zhuǎn)染EmGFP，感染痘苗病毒)，75%乙醇(國藥集團，北京)，PBS、1640培養(yǎng)基、DMEM購自Gibico公司，6孔板與96孔板分別購于NEST公司，EXPRESS SYBR?GreenERTMmiRNA qRT-PCR 檢測試劑盒(Invitrogen，USA)。

(2) 儀器。AVISO細胞分選儀 (德國Greiz-Gommla公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 細胞挑選程序的設(shè)置

首先從CellCelector細胞挑選模塊中選取直徑為

50 μm的玻璃毛細管作為挑選工具，將待選細胞板、目標板、PBS、75%乙醇分別放在固定位置(見圖1)。雙擊打開Cellcelector software軟件，將儀器與電腦軟件相連，彈出運行程序?qū)υ捒?，選擇“Init Device”進行初始化設(shè)備。檢測毛細管和管道是否存在氣泡，如果有大的氣泡，點擊“Program”中的“System liquid manager”按程序手動點擊“Next”通直到氣泡被排除。點擊“Configure decktray”、“Heating”、“Cell types”設(shè)置目標板及收集細胞孔的位置、加熱器的溫度(37 ℃)、細胞類型等相關(guān)參數(shù)(見圖2)。點擊“Sterilize”，機械臂自動將挑選細胞的玻璃毛細管置于75%乙醇中消毒5 s，可反復(fù)操作多次。

1-倒置顯微鏡，2-自動化載物臺，3-CCDS顯微鏡，4-自動機械臂，5-一次性槍頭，6-目標板圖1 AVISO全自動細胞分選儀

2.2 細胞挑選位置的校準

挑選位置的校準對于單細胞或細胞克隆團的精確挑選至關(guān)重要。首先進入“Program”，點擊“Calibrate Pickup Position”，從X軸、Y軸與Z軸三層面進行準確緩慢校準，調(diào)整合適的參數(shù)直至毛細管與電腦界面設(shè)置的中心位置相對稱(見圖3)，綠色的“Plate base not touched”轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的“Plate base touched”即表示毛細管已接觸到細胞板底面，再繼續(xù)點擊Z軸的“↑”，“Next”，“End”鍵直至機械臂自動歸位。

圖2 AVISO細胞分選儀相關(guān)參數(shù)設(shè)置界面

2.3 細胞挑選

細胞類型不同，挑選參數(shù)的設(shè)置也不同。最佳參數(shù)的優(yōu)化對于細胞的成功挑選至關(guān)重要。Ec-109細胞為食管癌細胞，具有較強的貼壁能力，在挑選參數(shù)設(shè)置時可增加吸取速度值到45，但挑選為單個細胞，因此吸液量設(shè)置較低為0.1 μm，每次吸入細胞數(shù)設(shè)置為

圖3 AVISO細胞分選儀挑選位置校準參數(shù)界面及其校準圖

1個(見圖4)。而BHK細胞盡管為貼壁細胞，但感染痘苗病毒后，貼附能力降低，因此在挑選參數(shù)設(shè)置時降低吸取值優(yōu)化至25，由于吸取細胞團感染病毒且成簇，因此將吸液量設(shè)置為0.3 μm。

圖4 細胞類型與挑選參數(shù)設(shè)置表

在儀器的使用過程中，用戶可以自由設(shè)定細胞特征參數(shù)(如形態(tài)學(xué)、熒光信號等)。相機根據(jù)參數(shù)要求自動掃描培養(yǎng)皿的設(shè)定區(qū)域，檢測到目的細胞并將位置數(shù)據(jù)自動傳到軟件。實驗中，因篩選細胞均轉(zhuǎn)染EmGFP基因，以綠色熒光信號為特征參數(shù)。開啟熒光燈界面，選擇2通道，即GFP綠色通道，選擇所需要細胞克隆，點擊“Pick selected particle”， 并能連續(xù)選取細胞在“Add Particle from live image” (見圖5、6)。

圖5 細胞挑選設(shè)置參數(shù)

圖6 細胞挑選添加菜單

2.4 實驗結(jié)果

Ec-109細胞轉(zhuǎn)染了既表達miR-203又能表達EmGFP的質(zhì)粒。挑選中，以綠色熒光蛋白為特征參數(shù)，選取熒光強度高的單個細胞，以15個單細胞為一組，機械臂自動將挑選好的細胞按設(shè)定位置放入96孔板中。之后置37 °C孵箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶壁時觀察熒光感染率達到90%以上，細胞活性高，提取RNA，檢測miR-203的表達，表達溶解曲線圖如圖7所示。

圖7 Ec-109細胞挑選與miR-203的檢測結(jié)果

感染痘苗病毒的BHK細胞經(jīng)過第1次挑選后低溫破碎細胞，釋放病毒液并感染正常細胞，培養(yǎng)24 h后病毒感染率在60%左右。將感染后的發(fā)綠色熒光細胞團二次挑選，再一次感染正常BHK細胞，細胞的感染率達到95%以上(見圖8)。

圖8 BHK細胞挑選與感染結(jié)果

3 結(jié) 語

AVISO全自動細胞分析分選系統(tǒng)CellCelector將細胞篩選提高到可視化的水平，與常規(guī)篩選方法相比，節(jié)約了操作時間，顯著提高了實驗效率。該系統(tǒng)除可全自動細胞分選外，還能進行細胞樣品處理與分析，是高通量細胞生物學(xué)分析最有效的研究平臺[12,13]。操作樣本不需要特殊處理，待分離的細胞可直接被吸入到50nl-12 μl液體培養(yǎng)基、基底膜或甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，細胞克隆或組織片段也可以被金屬刮取毛細管通過刮取移動模式從細胞群中成功分離，這對于玻璃載玻片上的組織切片和液體培養(yǎng)基中的克隆細胞尤為重要[14-15]。

此外，該系統(tǒng)收集細胞方便，收獲的細胞或組織材料可以被自動轉(zhuǎn)移到任何種類的培養(yǎng)器皿，像細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板、玻璃載玻片等。高精度細胞定位使單細胞微孔板鋪板，單細胞、或單細胞PCR制備變?yōu)榭赡?，為細胞生物學(xué)的深入研究提供了有力的手段。

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Optimization and Application of Single Cell Screening by Automated Cell Selector

ZHANGFang,LILi-li,YANGYi-shu,LIJin-tao,SHENGWang,LIZe-lin,ZENGYi

(Department of Life Science and Bioengineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China)

A novel, facilitate and rapid high-throughput technology for cell directional selection was introduced. The operation processes of single cell selection and optimization were detailly described by using Ec-109 cells and BHK cells as examples. Firstly, the screening software in the computer was connected with microscope. The appropriate parameters of screening were setting according to the cell type, and the location of screening was calibrated from theXaxis,Yaxis andZaxis. The target cells were selected accurately through freely setting cell feature parameters. Finally, cell screening rates were detected and analyzed, and the results could reach above 90%. The new automated screening technology of single cell can be achieved to the visual level compared with the conventional screening method. The sample doses not need special treatment, and cells are collected conveniently. The new method saves the operating time, and improves the experiment efficiency significantly.

automated cell selector; cell screening; characteristic parameter

2014-07-29

國家科技重大專項(2014ZX10005002)；北京市教委科技面上項目(KM201510005027)；北京工業(yè)大學(xué)研究生課程建設(shè)項目(CR2013-B-015)

張 芳(1976-),女,山西晉中人,博士,助理研究員,主要從事于納米藥物分子抗腫瘤的研究。

Tel.:010-67392780;E-mail:zhangfang2000@bjut.edu.cn

G 633.91

A

1006-7167(2015)05-0021-03