熟蛋殼膜微觀形貌及其拉曼光譜分析

狄 伶

(上海交通大學 分析測試中心，上海 200240)

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熟蛋殼膜微觀形貌及其拉曼光譜分析

狄 伶

(上海交通大學 分析測試中心，上海 200240)

為了有效利用熟蛋殼膜，初步檢測了其微觀形貌和表面分子基團,評價其回收可利用性。模擬烹調工藝，制備熟蛋殼膜；使用掃描電鏡觀察熟蛋殼膜微觀形貌；使用拉曼光譜儀檢測熟蛋殼膜表面分子基團。實驗結果顯示：熟蛋殼膜在經過高溫烹煮后仍然保持纖維網狀結構。殼膜纖維輕微溶脹，但未塌陷成片。熟蛋殼膜表面分子基團拉曼光譜信號減少，蛋白質主要發生構象改變。初步推斷熟蛋殼膜具有可回收可利用性。

熟蛋殼膜； 拉曼光譜； 微觀形貌

0 引 言

人們在日常生活中發明了很多食用雞蛋的方法，其中最簡單、營養價值獲取率最高的為煮雞蛋[1]，因此熟雞蛋殼在廢棄蛋殼中占有相當的比例。我國是禽蛋產業大國，每年的禽蛋產量高達數千萬t，相應產生的廢棄蛋殼高達數百萬t。這些棄置蛋殼直接造成了環境的污染和資源的浪費。目前，對廢棄蛋殼的綜合利用正逐漸受到海內外學者的廣泛關注[2-3]。

雞蛋由外至內依次是蛋殼、蛋殼膜(Eggshell Membranes，EM)、蛋清和蛋黃。由此在各組分間形成3個界面，分別是：①蛋殼與蛋殼膜的界面；②蛋殼膜與蛋清的界面；③蛋清與蛋黃的界面。我們在分析蛋殼膜時，定義其殼面，即與蛋殼的界面為外殼膜(Eggshell Membranes Towards Eggshell，EMEs)；定義其蛋面，即與蛋清的界面為內殼膜(Eggshell Membranes Towards Egg，EME)[4]。蛋殼富含碳酸鈣(約93%)，外形圓潤質地堅硬；蛋殼膜富含蛋白質(約90%)，質地柔軟具有通透性，兩者共同包繞保護卵內容物[5-6]。蛋白質在一定的物理、化學因素作用下，會發生空間構象改變，從而引發理化性質的改變和生物活性的喪失，這種現象即是蛋白質變性[7]。研究發現，雞蛋在沸水中烹煮超過10 min，內部會發生一系列的理化變化(這種過程即熱變性)，然而變性的蛋白質更易被人體的消化酶分解，利于吸收[8]。

熟蛋殼膜富含蛋白質，經過烹煮工藝也發生熱變性。為了有效利用熟蛋殼膜資源，我們使用掃描電鏡觀察熟蛋殼膜(Cooked Eggshell Membranes，CEM)的微觀形貌，并對其表面分子基團進行拉曼光譜檢測，初步分析熟蛋殼膜的回收可利用性。

1 實驗部分

(1) 材料與設備。材料：取市售草雞蛋待用。設備：低真空超高分辨場發射掃描電子顯微鏡(型號Nova NanoSEM 230，美國FEI公司)；離子濺射儀(型號E-1045，日本Hitachi公司)；色散型共聚焦拉曼光譜儀(型號Senterra R200-L，德國Bruker Optics公司)。

(2) 實驗方法。樣品的前處理：將洗凈的雞蛋放入水中浸泡1 min(防止蛋殼煮爆)，小火煮沸后溫火煮8 min。撈出煮熟的雞蛋在冷水中浸泡0.5 min，以便于剝離出蛋殼膜。熟蛋殼膜室溫干燥并保存。

電鏡觀察前使用離子濺射儀對待測面進行噴金以降低生物樣品由于不導電而產生的荷電現象，噴金條件：15 mA，30 s(10 nm/min)；掃描電鏡參數：Accelerate voltage， 5 kV。

拉曼光譜檢測參數：激發器波長為785 nm；激光功率100 mW；曝光時間和累積次數分別為2 s和2；光譜分辨率9 cm-1；實驗采集的波數范圍為250～3 300 cm-1；原始光譜數據使用拉曼光譜儀自帶軟件OPUS 7.2作圖，對光譜數據進行主成分分析。

2 實驗結果與討論

在前期工作中，我們使用掃描電鏡觀察了蛋殼及殼膜的微觀形貌[4]。蛋殼膜與蛋清相交處為一層纖維混蛋清結構，由黏稠蛋清侵入蛋殼膜，受蛋殼膜多層纖維阻滯而成。在分離蛋殼膜時，蛋面的斷裂處主要產生在蛋清處，因此蛋殼膜的蛋面是一個相對光滑的表面。觀察到在與細胞共培養時，正是這種表面很難使細胞黏附于其上。然而，蛋殼膜的殼面斷裂處主要在蛋殼膜纖維處，因此暴露出大量的纖維網狀結構(偶見脫落的蛋殼碎片)。

我們觀察到熟蛋殼膜的微觀形貌：①其殼面有較明顯的溶脹、塌陷現象(如圖1B)，這與生蛋殼膜遇水溶脹后的結構相似，但溶脹程度有所不同。推測溶脹在一定溫變范圍內比較迅速，隨著蛋白質構象的改變，溶脹趨勢有所減緩。因此形成的纖維網狀結構塌陷程度較低，并未完全塌陷成片呈封閉狀態；②熟蛋殼膜蛋面的微觀形貌比生蛋殼膜的更加粗糙(如圖1c，C)。我們推測這是由于水蒸汽分子在界面處的流通增加了界面的粗糙度。綜上：從熟蛋殼膜的微觀形貌來看，熟蛋殼膜保留了生蛋殼膜的多層纖維網狀結構，盡管發生了一定程度的溶脹和塌陷，并不影響自有結構的保持。而熟蛋殼膜蛋面粗糙度的增加，我們認為這種微觀形貌也許更利于細胞黏附。

(a,b,c)生蛋殼膜(A,B,C)熟蛋殼膜

圖1 蛋殼膜的微觀形貌

蛋白質在加熱過程中維持蛋白三級結構的疏水鍵和氫鍵被破壞，亞基肽鏈結構趨于松散，但并不導致蛋白質肽鍵斷裂[8-9]。加熱超過100℃，蛋白質分子雙螺旋結構開始展開，其二、三級結構(α-螺旋、β-折疊、β-回旋隨機卷曲結構)隨之發生改變，其中α-螺旋明顯減少；加熱至120 ℃，蛋白質分子充分展開。

殼膜富含角蛋白，角蛋白的主要成分是含巰基的半胱氨酸(Cys)[10]。加熱使半胱氨酸鏈上的二硫鍵斷裂、硫基被氧化[11]。半胱氨酸包含3種骨架結構，C-C-N骨架振動出現在366 cm-1，C-C-S骨架變形出現在215 cm-1和98 cm-1。結合我們前期對蛋殼膜的拉曼光譜分析[12]，熟蛋殼膜的殼面和蛋面在<400 cm-1的范圍內拉曼信號都減弱至消失(見圖2)，說明半胱氨酸的構象發生了一定程度的改變。此外，在蛋白質和多肽的拉曼光譜中，S-S和C-C的伸縮振動帶出現在500～700 cm-1[13]。其中C-C-S-S-C-C因峰值不同可能有三種構型，分別是扭曲-扭曲-扭曲式((510±5) cm-1)、扭曲-扭曲-反式((525±5) cm-1)和反式-扭曲-反式((540±5) cm-1)構象；C-S鍵有兩種構象，分別是630～670 cm-1扭曲構象和700～745 cm-1反式構象[14-16]。如圖2所示：熟蛋殼膜的殼面和蛋面在600～750 cm-1處有較明顯的變化，說明熟蛋殼膜主要發生C-S構象的變化。此外，蛋殼膜還富含膠原蛋白，酰胺I的C=O伸縮振動在1 669 cm-1和1 637 cm-1，酰胺II的N-H彎曲振動和C-N伸縮振動在1 557 cm-1，酰胺III帶的N-H彎曲振動譜線在1 267 cm-1和1 245 cm-1[13]，熟蛋殼膜在這些波數范圍均無明顯變化。由苯丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的芳香基團引起的強拉曼光譜吸收主要體現于800～1 100 cm-1，苯丙氨酸的特征吸收頻率為1 004 cm-1、1 033 cm-1，甲基和亞甲基的振動在1 451 cm-1、2 900～3 000 cm-1[10]。熟蛋殼膜在800～1 000 cm-1拉曼信號有較明顯變化，我們推測芳香基團發生了氧化。熟蛋殼膜在1 400～1 500 cm-1、1 600～1 700 cm-1、2 800～3 000 cm-1均無明顯變化。綜上：熟蛋殼膜不管是蛋面還是殼面，其表面分子基團主要發生構象變化。芳香基團決定親脂疏水性，熟蛋殼膜芳香基團拉曼信號的減弱也許也許更利于細胞黏附。

圖2 蛋殼膜在785 nm光源下的拉曼光譜圖

3 結 語

熟蛋殼在廢棄蛋殼中占有相當的比例，為了有效利用這部分資源，使用掃描電鏡和拉曼光譜儀初步觀察分析熟蛋殼膜的回收可利用性。經過高溫烹煮，熟蛋殼膜發生了熱變性，其形貌和理化性能相應發生改變。輕微溶脹的纖維網狀結構和部分表面分子基團的氧化并不制約熟蛋殼作為組織工程材料的適用性。我們推測熟蛋殼膜的熱變性可能更利于其與細胞的互作，值得進一步分析研究。

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Microstructure Analysis of Cooked Eggshell Membrane and Its Raman Spectroscopy Detection

DILing

(Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Cooked eggshells occupy a considerable proportion of waste eggshells. After cooking, eggshell membranes thermal denaturize, physical and chemical properties change. In order to effectively use cooked eggshell membranes, we tested its microstructure and surface molecular groups. The microstructure and surface molecular groups of cooked eggshell membranes were detected, the recycling availability was preliminarily evaluated. By mimicking the cooking process cooked eggshell membranes were prepared. The microstructure was detected by SEM. The surface molecular groups were detected by Raman spectroscopy. It showed that cooked eggshell membranes remained fibrous mesh structure with slight swelling fibers, while the fibers did not collapse into pieces. The surface molecular groups decreased and it was mainly protein conformational change. We concluded that cooked eggshell membranes have recyclable availability.

cooked eggshell membrane; Raman micro-spectroscopy; microstructure

2014-08-01

狄 伶(1981-)，女，回族，寧夏固原人，博士，助理研究員，研究方向：醫用生物材料。

Tel.:021-34206175-221；E-mail：di_l@sjtu.edu.cn

O 657.37

A

1006-7167(2015)05-0039-03