基于EDS的魚類耳石微化學分析實驗條件選擇

郭弘藝， 張旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大學 農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

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基于EDS的魚類耳石微化學分析實驗條件選擇

郭弘藝， 張旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大學 農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306)

研究能譜儀在魚類耳石微化學分析中的應用，探索一套適用于魚類耳石標準樣品定量分析實驗條件。結果表明，樣品表面粗糙會對特征X射線產生幾何效應，使得分析強度降低，造成實驗結果誤差。耳石樣本最適用烘干干燥法，其操作過程為：耳石放入干凈培養皿后，在恒溫烤箱60 °C烘干6～8 h。樣品干燥后，表面噴金待用。為獲得精確的分析結果，實驗參數應根據樣品大小，實驗目的所需要關注的組成元素和儀器性能來選擇。加速電壓Uo一般為臨界激發電壓Uk的2～10倍。最適工作距離為20 mm，單點掃描活時間為200 s以上，死時間10%～15%。聚焦參數應該根據耳石樣品不同的大小選擇，盡可能兼顧縮短測量時間和保證足夠的空間分辨率。

耳石； 掃描電鏡； 能譜儀； 魚類

0 引 言

魚類耳石具有代謝惰性，在生長發育過程中，水環境中的化學元素一旦被耳石沉積，就很難再被機體吸收，成為記錄魚類生活史的元素指紋。因此，耳石微化學分析已成為解決魚類生活史及環境史重新構建、出生地溯源、混合群體識別、種群鑒定、海洋環境反演等問題的關鍵技術[1-5]。

X射線能量色散譜分析(Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy, EDS)，簡稱X-射線能譜分析，是20世紀70年代迅速發展起來的一種元素測試技術，可配置在掃描電子顯微鏡或透射電子顯微鏡上，能對樣品做無損傷分析，具有操定性、定位和定量分析一次完成的優點[6-14]。目前，國內眾多科研院校均配置了掃描電子顯微鏡與能譜儀，但對魚類微化學領域研究較少，特別缺乏魚類耳石微化學研究的能譜分析實驗手段和技術研究。本文利用我校現有的日立S-3400N型掃描電鏡配置布魯克 QUANTAX 400-10 型能譜儀，基于EDS的魚類耳石微化學分析實驗條件的進行探索和研究，以期為從事該領域研究的人員提供幫助。

1 實驗方法

1.1 主要儀器

SEM 試驗儀器為日立S-3400N型掃描電鏡；EDS試驗儀器為布魯克 QUANTAX 400-10 型能譜儀(ESPRIT 1. 9 軟件系統)；探測器為SSD硅漂移探測器。

1.2 試驗樣品

分析樣品為刀鱭成魚和日本鰻鱺幼魚的矢耳石(見圖1)。

圖1 刀鱭成魚和日本鰻鱺幼魚耳石

1.3 分析流程

分析流程如圖2所示，重復多次測試，篩選最適合實驗條件。

2 結果和分析

2.1 耳石樣品制備和實驗前預處理

2.1.1 耳石制備

已有研究表明，樣品表面粗糙會對特征X射線產生“幾何效應”：一方面是所產生的一部分X射線射出后被邊緣突起部分吸收；另一方面在不同角度的表面上所產生的X射線，有相當一部分背離探測器的方向。由于這兩部分X射線的損失，使得分析強度降低，造成實驗結果誤差[15]。本實驗結果表明，表面未經拋光的耳石樣品分析誤差明顯大于均勻打磨至100 μm薄片的耳石誤差，均一厚薄光滑表面的耳石樣品較未經處理的不均一粗糙表面樣品，鈣和鍶元素分析誤差分別由4%和8.9%降至1%和5.8%(見表1)。由此可見，耳石樣品需打磨成為厚薄均一的耳石薄片。

圖2 EDS分析流程示意圖 表1 EDS法分析耳石表面元素含量及其相對誤差

元素未打磨拋光的樣品打磨至100μm均勻薄片樣品鈣Ca鍶Sr含量×10-6251236.7±9931.4236813.2±2402.3誤差/%4.01.0含量×10-63225.6±285.82703.8±155.8誤差/%8.95.8

2.1.2 干燥法的選擇

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法包括自然干燥法、烘干干燥法、冷凍干燥法、臨界點干燥法和真空干燥法。5種方法均可用于耳石的干燥，比較而言，冷凍干燥法、臨界點干燥法和真空干燥法或需要專門設備和試劑，或操作復雜，而自然干燥法受溫度和濕度影響且耗時長。因此，耳石樣本最適用烘干干燥法，此法干燥速度較快，操作簡單，所需設備容易獲得。其操作過程為：耳石放入干凈培養皿后，在恒溫烤箱60 °C烘干6～8 h。需要注意的是，恒溫烤箱溫度設置過高，易導致耳石碎裂，而烘烤溫度設置太低，干燥所需時間長。

2.1.3 表面噴鍍材料選擇

耳石樣品不導電，測試前需經過噴金(Au)或噴碳(C)處理。由于耳石的主要元素為Ca、C、O，以碳酸鈣(CaCO3)的形式存在，噴碳可能造成C含量疊加，因此，選擇噴Au更為合適。同時，在分析時，控制窗口Element list中選中Au元素，將其設定為Deconvolution元素，即普線圖上仍顯示Au元素譜峰，但不納入后續定量計算。

2.2 實驗條件的選擇

2.2.1 加速電壓的選擇

使用EDS分析耳石元素含量時，首先，應選擇合適的加速電壓Uo，并檢查過壓比。過壓比為“加速電壓Uo與某一分析元素給定譜線的臨界激發電壓Uk的比值”。當過壓比低于50%，被激發元素的相互作用體積很小，不足以應用于X射線分析；當過壓比大于10倍時，低能量的X射線會逃逸，造成很大誤差。例如，當實驗過程中關注Ca和Sr元素的含量，激發Ca和Sr的Kα能量分別為3.7和14.1 keV，同時，兼顧兩者的分析效果，實驗選取30 kV加速電壓。

2.2.2 探測器工作距離

當探測器調到最佳工作位置時，才可獲取最佳分析效果，得到最高探測能效。本研究中，日立S-3400N型掃描電鏡附帶布魯克 Quantax 400-10 型能譜儀的工作距離是20 mm。

2.2.3 采集時間

耳石定量分析所需單點掃描活時間為200 s以上，死時間*死時間,是指射入檢測器的沒被采用的X射線信號10%～15%，效果較好。面掃描和線掃描在不精確定量，僅分析耳石內元素空間變化的情況下，可根據樣品情況和分析要求，降低單點掃描活時間。

2.2.4 聚焦參數選擇

束斑大小選擇要同時兼顧盡可能短的測量時間和足夠的空間分辨率。當樣品為成魚耳石時，如刀鱭成魚耳石，耳石半徑約2 000 μm，生長率為50 μm/周。因此，束斑可選擇25 μm左右，即得到足夠的空間分辨率反映生活史中元素變化；當樣本為仔幼魚耳石時，如日本鰻鱺幼魚耳石，耳石半徑為150 μm，生長率為0.5～2 μm/日。此時，束斑應選擇2～5 μm，以探得生活史中元素變化。

2.3 標準物質的選擇

按照《電子探針和掃描電鏡X射線能譜定量分析通則》，應選擇與分析樣品基質性質接近，厚度相同的標準物質，同時，分析樣品和標樣應在相同分析條件下采集譜圖，從而保證分析的精確度。據此，我們選用加拿大國家研究委員會提供的新型魚類耳石標準物質(FEBS-1)。該標樣由4.5 kg干燥的西大西洋笛鯛矢耳石制備而成，適用于定量鋇、鈣、鋰、鎂、錳、鈉和鍶7種元素。其基質成分與分析樣品比較接近，同時，FEBS-1為粉末狀，可靈活制備成不同厚度，以適用于不同大小魚類耳石的定量分析。

3 結 語

在EDS分析前，應將魚類耳石打磨成為厚薄均一的耳石薄片，恒溫烤箱60 °C干燥6～8 h后，表面噴金待用。EDS分析實驗條件應根據樣品大小，實驗參數應根據樣品大小，實驗目的所需要關注的組成元素和儀器性能來選擇。Uo一般為臨界激發電壓Uk的2～10倍。本研究中的日立S-3400N型掃描電鏡附帶布魯克Quantax 400-10型能譜儀的最適工作距離為20 mm，單點掃描活時間為200 s以上，死時間10%～15%。聚焦參數應該根據耳石樣品不同的大小選擇，盡可能兼顧縮短測量時間和保證足夠的空間分辨率。研究結果表明，標準物質FEBS-1是基質成分與耳石接近，厚薄大小可靈活制備，滿足魚類耳石微化學定量分析。

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Experiment Condition Selection and Research of Fish Otolith Microchemistry Analysis Based on EDS

GUOHong-yi,ZHANGXu-guang,SHAOLu,YINXi-ming

(Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

This paper studies the application of spectrometer in fish otolith microchemistry analysis, and explores a set of experiment conditions for quantitative analysis of fish otolith standard samples. For electron microprobe analysis the otoliths were ground into uniform thickness chips, then dried at 60°C constant-temperature oven for 6-8 hours, and finally gold coated in a high-vacuum evaporator. In order to ensure the accuracy of experimental results, experiment parameters should be determined in accordance with otolith size, experimental objective for key composition of fish otolith and instrument performance. Accelerating voltage must be higher than X-ray critical excitation voltage of all element properties measured, which is more than 2 times and less than 10 times of critical excitation voltageUkin general cases. The optimal working distance is 20 mm, with live time of over 200 s and deadtime between 10%-15% in single scan. Focusing parameters should be determined on line with otolith sample size, with full considerations to a short measurement time and sufficient spatial resolution.

otolith; scanning electron microscopy; energy spectrometer; fish

2014-07-07

上海高校實驗技術隊伍建設計劃(B1-5407-13-0000-1)

郭弘藝(1980-)，女，江蘇揚州人，工程師，現主要從事魚類生物學研究。Tel.:021-61900445；E-mail:hy-guo@shou.edu.cn

Q 336

A

1006-7167(2015)05-0024-03