子癇前期孕婦體內S100A12水平檢測及其血清對滋養細胞增殖、凋亡和RAGE表達的影響

趙先蘭，潘淑敏，劉 彩

鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052

子癇前期孕婦體內S100A12水平檢測及其血清對滋養細胞增殖、凋亡和RAGE表達的影響

趙先蘭△，潘淑敏，劉 彩

鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052

△女，1965年10月生，博士，主任醫師，研究方向：圍產醫學，E-mail：zxl12129@163.com

子癇前期；S100A12；RAGE；滋養細胞；細胞增殖；細胞凋亡

目的：檢測子癇前期孕婦外周血和胎盤組織中S100A12蛋白的表達，觀察其血清對滋養細胞的影響，探討S100A12與子癇前期的關系。方法：選擇輕度子癇前期孕婦30例，重度子癇前期孕婦30例，同期入院分娩的正常孕婦30例(正常對照組)，采用ELISA法檢測孕婦外周血中S100A12水平，免疫組化法檢測胎盤組織中S100A12蛋白的表達水平。用各組孕婦血清體外培養滋養細胞48 h，另設無血清培養的空白對照組，應用MTT法和流式細胞儀檢測細胞增殖及凋亡情況，Western blot 法檢測細胞中晚期糖基化終末產物受體RAGE蛋白的表達。結果：輕、重度子癇前期組孕婦外周血及胎盤組織中S100A12水平均高于正常對照組(P<0.05)，且重度子癇前期組高于輕度子癇前期組(P<0.05)。輕、重度子癇前期組滋養細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率及RAGE蛋白的表達均明顯高于正常孕婦及空白對照組(P<0.05)，增殖率則降低(P<0.05)；重度子癇前期組較輕度子癇前期組變化更顯著(P<0.05)。結論：S100A12高表達可能是子癇前期的重要發病機制之一。

子癇前期是導致孕產婦和圍產兒患病率及死亡率升高的主要原因之一，其發病機制迄今不明。研究[1]表明其病理根源在于胎盤。近年來子癇前期發病的炎癥機制再次受到重視。S100A12是近年來發現的一種促炎因子，在炎癥調節中起關鍵作用，參與機體的免疫防御或炎癥反應，調節細胞生長分化、生長抑制、凋亡等，在炎癥性腸病、關節炎、心血管疾病等許多疾病中發揮著重要作用[2]。目前尚不清楚S100A12與子癇前期之間的關系。該研究通過檢測S100A12在子癇前期孕婦血清及胎盤中的表達，分析子癇前期孕婦血清對滋養細胞增殖、凋亡及晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)表達的影響，探討其與子癇前期發病的關系，為進一步尋找子癇前期的預測指標及治療靶點提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2013年3月至12月在鄭州大學第一附屬醫院產科分娩的子癇前期患者60例,參照文獻[3]的診斷標準及分類，其中輕度30例，年齡23～30(27.3±4.0)歲，孕1～3(1.6±0.7)次；重度30例，年齡25～32(29.1±2.7)歲，孕1～3(1.8±0.9)次。選擇同期正常孕婦30例為正常對照組，年齡23～30(26.2±2.2)歲，孕1～3(1.7±0.6)次。所選研究對象均無其他妊娠期合并癥及并發癥。3組產婦年齡、孕產次等一般情況匹配。

1.2 標本的采集、處理及保存 采取孕婦空腹狀態下肘靜脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中，3 000 r/min 離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱中保存備用。胎盤娩出后，在胎盤母體面中央避開出血、梗死及鈣化區取胎盤組織約1 cm×1 cm×1 cm，冷生理鹽水沖洗干凈后,甲醛固定。

1.3 外周血中S100A12水平的測定 以離心后血清為標本，采用ELISA法按試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)說明操作，在450 nm處測得吸光度(A)值，以標準物的濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線計算出外周血中S100A12水平。

1.4 胎盤組織中S100A12蛋白的檢測 固定后的胎盤組織常規石蠟包埋，連續切片，厚4 μm，脫蠟至水；用體積分數3%H2O2清除內源性過氧化物酶；采用免疫組化SP法檢測胎盤組織中S100A12蛋白。S100A12抗人一抗購于美國Abcam生物技術公司，嚴格按免疫組化法操作步驟進行。以PBS代替一抗作陰性對照。參照Fromowitz等[4]陽性細胞半定量分級法，觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，根據陽性細胞所占百分數計分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以兩項得分相加的總分進行判定：<2分為陰性，≥2分為陽性。

2 結果

2.1 各組孕婦外周血中S100A12水平和胎盤組織中S100A12蛋白表達的比較 見圖1、表1。各組孕婦胎盤滋養細胞、蛻膜細胞等組織細胞中均可檢測到S100A12蛋白的陽性表達，蛋白定位于細胞質中。輕度子癇前期組及重度子癇前期組孕婦外周血中S100A12水平和胎盤組織中S100A12蛋白陽性表達率均高于正常對照組，重度子癇前期組高于輕度子癇前期組。

圖1 各組胎盤組織中S100A12蛋白的表達(SP，×200)

表1 3組孕婦外周血中S100A12水平及胎盤組織中S100A12陽性表達率比較

*：與正常對照組比較，P<0.001；#:與輕度子癇前期組比較，P<0.001。

2.2 子癇前期孕婦血清對滋養細胞增殖、凋亡和RAGE表達的影響

2.2.1 各組滋養細胞增殖情況的比較 用輕、重度子癇前期組孕婦血清孵育滋養細胞 48 h后，倒置相差顯微鏡下可見，細胞形態由長梭形或多邊形變為橢圓或圓形，細胞間隙加大，細胞排列變疏松；正常孕婦組和空白對照組細胞形態基本正常、無變化。輕、重度子癇前期組細胞增殖率明顯低于正常孕婦組和空白對照組；重度子癇前期組低于輕度子癇前期組。見表2。

2.2.2 各組滋養細胞凋亡率的比較 輕、重度子癇前期組滋養細胞早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率均明顯高于正常對照組及空白對照組。見表2。

2.2.3 各組細胞RAGE蛋白表達的比較 輕、重度子癇前期組滋養細胞中RAGE蛋白的表達均明顯高于正常對照組及空白對照組，見圖2、表2。

圖2 各組滋養細胞中RAGE的表達

1：空白對照組；2：正常對照組；3：輕度子癇前期組；4：重度子癇前期組。

表2 4組滋養細胞增殖、凋亡和RAGE表達的比較

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與正常組比較，P<0.05；△：與輕度組比較，P<0.05。

3 討論

S100A12是一種存在于中性粒細胞中的胞質蛋白, 是一種相對分子質量較小的酸性蛋白，屬于細胞表面免疫球蛋白超家族中的一員[5]，具有S100蛋白家族的一些共性，有獨有的結構和功能特點，是一種具有促進炎性反應的鈣結合蛋白，其主要作用是使血管內皮細胞黏附分子表達上調，激活炎性細胞、化學趨化和抗微生物作用[2]。Saito等[6]研究表明慢性冠狀動脈疾病患者血清S100A12水平與C反應蛋白水平呈正相關。RAGE是一種多配體的膜受體，與配體結合后可啟動多條信號通路，引起細胞內氧化應激和炎癥反應等，導致細胞功能紊亂[7-8]。S100A12與其受體RAGE結合后可激活包括磷脂酶C、蛋白激酶C、鈣調蛋白激酶Ⅱ、分裂原激活蛋白激酶的激酶等[9]途徑，最終促使NF-κB入核，調節重要的目的基因的表達，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等，這些細胞因子可促進炎癥發生。同時NF-κB也是RAGE基因的核轉錄因子，可上調RAGE基因的表達。因此，S100A12-RAGE結合后可通過正反饋調節使信號級聯反應持續發生，使“炎癥-抗炎”系統失衡，形成機體內過度炎癥反應。

近來越來越多的學者認為，子癇前期是母體對妊娠的一種過度性炎癥反應。有學者[10-11]用內毒素刺激成功建立了子癇前期動物模型，且抗炎治療有效。國內外應用抗炎藥物干預子癇前期的研究[12]均表明早期應用小劑量阿司匹林可降低高危婦女子癇前期的發生率。也有學者[1]認為子癇前期病理根源在于胎盤。滋養細胞功能障礙導致血管重塑，胎盤淺著床進而導致胎盤缺血缺氧，胎盤發生缺血再灌注損傷，引起炎癥反應，炎癥因子釋放后再作用于胎盤，形成“炎癥-胎盤缺血損傷”正反饋，形成子癇前期的病理特征。

該研究結果顯示：S100A12在正常及子癇前期孕婦外周血及胎盤組織中均有表達，但在輕、重度子癇前期組高表達；進一步研究發現，子癇前期孕婦血清可抑制滋養細胞增殖，促進滋養細胞凋亡，而RAGE蛋白表達在子癇前期孕婦血清干預的滋養細胞中也呈相應的高表達。提示S100A12可能參與了子癇前期的發病過程，子癇前期孕婦胎盤組織局部分泌并釋放S100A12是其重要來源。S100A12正常表達于中性粒細胞，同時在淋巴細胞、單核細胞中有低表達。正常妊娠時，孕婦自身分泌少量S100A12蛋白，促進多種炎性介質的釋放，從而引發全身性炎癥反應，并在一定水平上維持“炎癥-抗炎”系統的平衡。當這種平衡被打破時，過多的炎癥因子可引起免疫細胞分泌包括S100A12在內的促炎因子，形成一個正反饋環路，S100A12的作用被放大，加重了靶器官的損傷，形成了子癇前期狀態下的病理改變。

綜上所述，S100A12在子癇前期的發病機制中可能發揮重要作用，然而其通過何種機制作用于子癇前期還需進一步研究。

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(2014-09-13 收稿 責任編輯王 曼)

Expression of S100A12 in preeclampsia and effects of serum from preeclampsia patients on proliferation, apoptosis and RAGE expression of trophoblast cells

ZHAOXianlan,PANShumin，LIUCai

DepartmentofObstetricsandGynecology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

preeclampsia;S100A12;RAGE;trophoblast cell;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To detect the expression of S100A12 in materal periphera blood, placenta of patients with preeclampsia, and investigate the effects of serum from the patients with preeclampsia on proliferation and apoptosis of trophoblast cells. Methods: A total of 60 women with preeclampsia(including 30 cases of mild preeclampsia and 30 cases of severe preeclampsia) and 30 healthy pregnant women(normal control group) were collected. The level of S100A12 protein in maternal peripheral blood was detected by ELISA. Immunohistochemistry method was used to measure the protein expression level of S100A12 in placenta. The trophoblast cells were cultured in vitro for 48 h with the serum from the three groups,and a blank control group was set up as well．The proliferation and apoptosis of trophoblast cell were measured by MTT assay and flow cytometry,and RAGE protein expression was measured by Western blot. Results: The level of S100A12 in maternal peripheral blood and placenta from patients with mild and severe preeclampsia was significantly higher than that of the normal control group(P<0.05). The proliferation rates of trophoblast cells in the mild and severe preeclampsia groups were significantly lower than those in normal control group and the blank control group(P<0.05).The early phase apoptosis rate，late phase apoptosis rate and total apoptosis rate and the level of RAGE protein of trophoblast cells in the mild and severe preeclampsia groups were significantly higher than those in the normal control group and the blank control group(P<0.05)． The changes of severe preeclampsia group were more significant than that of the mild group(P<0.05).Conclusion: The high expression of S100A12 protein may play an important role in pathogenesis of preeclampsia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.015

R714.51