胃癌組織中CD44v6、MMP-9蛋白的表達

王水生,趙春臨，丁朝輝，徐化楠，葉延偉

鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科 鄭州 450052

胃癌組織中CD44v6、MMP-9蛋白的表達

王水生,趙春臨#，丁朝輝，徐化楠，葉延偉

鄭州大學第一附屬醫院胃腸外科 鄭州 450052

#通信作者，男，1966年1月生，博士，主任醫師，副教授，研究方向：消化道腫瘤基礎與臨床，E-mail:zhaochunlin@zzu.edu.cn

胃腫瘤；CD44v6；MMP-9；浸潤轉移

胃癌是消化系統中常見的惡性腫瘤,其發病率呈逐年上升趨勢。惡性腫瘤的侵襲和轉移是引起患者死亡的主要原因，然而腫瘤侵襲和轉移是個多步驟多基因參與的復雜過程，涉及細胞與細胞外間質或與其他細胞的一系列相互作用。有研究[1-2]表明，黏附分子 CD44拼接變異體v6(CD44 splice variant v6，CD44v6)的過度表達及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性和表達的增強與胃癌浸潤、轉移及預后密切相關。作者運用免疫組化SP雙染技術檢測CD44v6和MMP-9蛋白在60例原發性胃癌及60例正常胃黏膜組織中的表達,探討其在胃癌浸潤、轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集鄭州大學第一附屬醫院2013年3月至2014年3月期間收治的胃癌根治手術患者60例，所有病例手術前均未曾接受過放化療、中醫及免疫治療。患者男32例，女28例；年齡42～75歲，<60歲29例，≥60歲31例；腫瘤直徑≥3 cm 18例，<3 cm 42例；浸潤深度：T0、16例，T231例，T3、423例；淋巴結轉移：N04例，N1、236例，N3、420例；TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期25例。

1.2 取材及制片 所有標本取材均在手術中標本離體后30 min內完成，每例手術標本均取癌灶組織和癌旁正常胃組織各2塊，每塊300～500 mg，無菌生理鹽水沖洗，濾紙吸干后裝入無酶EP管并立即投入液氮中，隨后轉至-70 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.3 CD44v6和MMP-9蛋白的免疫組化SP雙染法檢測 所有標本用甲醛固定，脫水，然后石蠟包埋，最后4 μm厚連續切片。實驗前加做抗體交叉實驗，未見交叉反應。嚴格參照說明書染色，混合一抗(稀釋200倍使用)，孵育條件為4 ℃過夜，并高壓蒸汽修復，以pH 6.0檸檬酸緩沖液作為抗原修復液，混合二抗(稀釋100倍使用)。陰性對照使用PBS代替一抗染色，以公司提供的已知陽性片作為陽性對照。CD44v6單克隆抗體、MMP-9多克隆抗體及Polymer雙染試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 結果判斷 CD44v6和MMP-9的陽性染色呈棕黃色及紅色顆粒或團塊狀，CD44v6主要表達于細胞膜，少數可見于胞質;MMP-9主要在近膜胞質中表達。由兩位病理醫師分別觀察，每張切片選取3個具有代表性的高倍視野(×400)，計數100個細胞，根據染色程度以及陽性細胞百分比進行評分。①染色程度:不著色為0分，著色淡為1分，中度著色為2分，著色深為3分。②陽性細胞百分比：<5%為0分， 5%～為1分， 25%～為2分，50%～為3分。兩者相乘為最后得分，0～1分為陰性(-)，2～3分為(+)，4～6分為()，>6分為()。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0分析。用配對χ2檢驗比較胃癌及癌旁正常胃組織中CD44v6 和MMP-9蛋白表達的差異，應用χ2檢驗分析胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白的表達與胃癌患者臨床病理特征的關系，應用Spearman相關分析胃癌組織中兩種蛋白表達的關系，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁正常胃組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達 胃癌組織中CD44v6主要定位于細胞膜和近膜的胞質(圖1 )，呈異質性表達，胃癌組織中CD44v6蛋白陽性表達率81.67%(49/60)，高于癌旁正常胃組織陽性表達率為15.00%(9/60) (表1)。MMP-9陽性表達產物在胃癌組織細胞中主要定位于細胞質，在60例胃癌組織中陽性表達率為73.33%(44/60)，在癌旁正常胃組織中陽性表達率為5.00%(3/60)(表2)。胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白陽性表達率均高于癌旁正常胃組織。

圖1 胃癌組織中CD44v6(A)和MMP-9(B)的表達(SP雙染, ×400)

表1 胃癌及癌旁正常胃組織中CD44v6蛋白的表達 例

表2 胃癌及癌旁正常胃組織中MMP-9蛋白的表達 例

2.2 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系 見表3。

表3 CD44v6與MMP-9蛋白的表達與胃癌臨床病理學特征的關系 例(%)

2.3 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白表達的關系 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達呈正關聯，見表4。

rS=0.036，P=0.009。

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉移是引起患者死亡的主要原因，然而腫瘤侵襲和轉移是個多步驟多基因參與的復雜過程，其中細胞黏附、基質溶解和細胞移動是癌細胞侵襲、轉移過程中的3個步驟[3]。

CD44是由單一基因編碼的單鏈膜表面糖蛋白家族，具有高度異質性，基因定位于第11號染色體短臂上[4],CD44v6是CD44家族中的一種變異形，它能與透明質酸結合，通過影響腫瘤細胞與基質的結合從而改變腫瘤細胞的浸潤及轉移能力。該研究結果發現胃癌組織中CD44v6蛋白的表達均高于正常胃組織;CD44v6在胃癌組織中的表達與胃癌浸潤深度及TNM分期密切相關，但與年齡、性別、淋巴結轉移、腫瘤的大小及生長位置無關。Okayama等[5]發現在胃腺癌組織中CD44v6陽性表達率明顯高于其在非典型增生胃黏膜及正常胃黏膜中的表達率，隨著腫瘤細胞浸潤深度的增加、淋巴結轉移，CD44v6陽性表達率顯著升高，但與年齡、性別及有無脈管侵犯無關。CD44v6強陽性表達的胃癌患者術后生存率均明顯降低，表明胃癌CD44v6的過度表達可能使胃癌細胞產生侵襲表型，以利于癌細胞的轉移[2]。該研究結果與以上結果基本相符，即胃癌的浸潤深度及TNM分期與CD44v6的表達有關，說明CD44v6確實在胃癌浸潤中扮演著重要的角色。

MMP-9是MMPs中的重要成員，能降解細胞外多種基質成分，其中就包括基底膜的主要成分Ⅳ型膠原[6]。腫瘤細胞表達MMP-9與其侵襲轉移能力有關[7]。Littlepage等[8]報道MMP-9參與了腫瘤新生血管的生成，新生微血管在結構上不完善，缺乏肌層，基膜不連續，這些結構特點喪失了組織對腫瘤侵犯的屏障作用，增加了腫瘤進入淋巴、血液循環的可能。有研究[9]表明MMP-9的表達和活性隨乳癌分級的增加而增高。對于胃癌既往研究[10]顯示，MMP-表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、病期密切相關，MMP-9強陽性表達者術后生存率顯著下降，提示MMP-9表達與胃癌的發展及預后密切相關，而MMP-9強陽性表達常常意味著胃癌病期較晚[2]。以上結果一定程度上說明了MMP-9在胃癌惡性生物學行為中發揮著重要的作用，其中在淋巴結轉移方面的結果與該實驗結果不完全一致。然而也有學者[11]表明MMPs在淋巴結轉移過程中的作用尚無統一結論。該研究有無淋巴結轉移患者MMP-9蛋白的表達未見顯著差異，原因可能有：①無淋巴結轉移的樣本量偏少。②胃癌特殊的“跳躍式”淋巴結轉移方式。

該研究結果顯示胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白表達有關聯。以往有研究[12]表明CD44v6有利于MMP-9錨定在細胞膜表面，通過影響細胞內骨架蛋白的構型和分布從而介導腫瘤浸潤和轉移。該研究結果與以上理論相符，可以推斷出CD44v6與MMP-9在胃癌浸潤轉移過程中相互關聯、協同作用。因此，聯合檢測兩者對胃癌治療的臨床實踐具有一定的指導意義，即對兩者表達均陽性的患者應采取更積極的治療措施。

[1]張成武,徐文娟,趙仲生,等.CD44V-6和E-CD的表達與胃癌生物學特性的關系[J].中華普通外科雜志,2000,15(4):4

[2]張成武,鄒壽椿,徐文娟,等.胃癌基質金屬蛋白酶-9表達的臨床意義[J].中國胃腸外科雜志,2000,3(1):25

[8]Littlepage LE,Sternlicht MD,Rougier N,et al.Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcinogenesis, metastasis, and angiogenesis progression[J].Cancer Res,2010,70(6):2224

(2014-10-01 收稿 責任編輯李沛寰)

Expression of CD44v6 and MMP-9 proteins in gastric cancer tissue

WANGShuisheng,ZHAOChunlin,DINGChaohui,XUHuanan,YEYanwei

DepartmentofGastrointestinalSurgery，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

gastric neoplasm;CD44v6;MMP-9;invasion and metastasis

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.031

R735.2