麻瘋樹組織培養研究

趙雪慧，何 德

（西南林業大學 生 命科學學院，云南 昆 明650224）

1 引言

在化石能源日益枯竭的今天，麻瘋樹（Jatrophacurcas）作為一種生物柴油樹種，生物質能源的重要來源，因為其果實的高含油量，越來越受到世界各國的關注。據報道，麻瘋樹的果實含油量能高達40%［1］。雖然麻瘋樹種子含油率很高，但是其果實的產量問題卻是一大難題，究其原因，麻瘋樹是一種雌雄同株異花的植物，雌雄花位于同一個花序，但是同一個花序的雌花的數量卻要遠遠小于雄花，有研究者指出麻瘋樹同一花序上，麻瘋樹的雌雄花比例大致為1∶10～1∶20［2～4］，這直接限制了麻瘋樹的大批量種子繁殖，于是各國學者紛紛將目光投向了組織培養。作為當今生物學領域普遍使用的繁殖技術，組織培養有許多的優點，能夠保存母本的優良性狀。目前關于麻瘋樹的組織培養已有一定的成果，許多研究者分別使用不同的外植體、不同激素、不同環境對麻瘋樹的組織培養進行了研究，普遍使用的是MS基本培養基，輔以BA、TDZ、IBA、NAA等外源激素，以實現麻瘋樹組培苗的快繁［5～10］。目前尚未見到使用其他基本培養基對麻瘋樹進行組織培養。組織培養是否能夠獲得成功，培養基的選擇是非常重要的一個環，不同的培養基具有不同的特點。MS培養基由于其無機鹽和離子濃度較高比較穩定，養分數量和比例合適，能滿足植物細胞所需要的營養和生理需要，被廣泛應用，但是其他種類的基本培養基在麻瘋樹的組織培養中是否會具有比MS培養基更高的效率呢，比如WPM培養基，被譽為木本植物培養基，是否會更適合麻瘋樹的組織培養？為了探究其他種類基本培養基在麻瘋樹組織培養中的表現，為麻瘋樹的組織培養研究做一個補充，本研究以麻瘋樹無菌苗為外植體使用了幾種基本培養基進行麻瘋樹的組織培養。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

麻瘋樹種子采自云南金沙江邊干熱河谷區，4℃條件下保存于西南林業大學生物技術實驗室。

硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硝酸鈣、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、肌醇、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、甘氨酸、升汞，均為分析純試劑；白砂糖；卡拉膠。

BS223S型電子天平（0.001g），Sartoruis；SX－500滅菌鍋，TOMY；BCD－196電冰箱，美菱；MW－2070M微波爐，海爾；SW－CJ－2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；1810－B型石英自動雙重純水蒸餾器，江蘇省宜興市勤華石英玻璃儀器廠；YBOFB2型空調，格力；T836W／765型日光燈，FSL佛山照明；LL－200P型電磁爐，佛山市順德區勞萊斯電器有限公司。其他工具還有移液槍，燒杯，量筒，容量瓶，玻璃棒，漏斗、剪刀、解剖刀、鑷子、酒精燈等。

2.2 方法

2.2.1 外植體表面消毒

將麻瘋樹成熟飽滿種子去殼后在次氯酸鈉與水1∶1的混合溶液中浸泡20 min，期間適當攪拌，接著流水沖洗干凈種子表面的次氯酸鈉，放入清水中備用。將處理好的種子放入超凈工作臺，首先使用75%酒精浸泡30 s，使用無菌水清洗3遍，每次浸泡3 min左右，去除殘留酒精。然后在0.1%的升汞溶液中浸泡15 min后用無菌水清洗3次，每次3～5 min，盡可能洗去升汞殘留。將消毒完成的種仁，放入無菌水中備用。

2.2.2 無菌苗的萌發

沿種仁縱軸切開，除去胚乳，小心取出完整的幼胚，胚軸向下接種于MS、LM、WPM、N6這4種基本培養基中，培養基中不添加任何外源植物激素。每種培養基20個重復，每個重復一個幼胚，觀察各培養基中無菌苗的生長情況，15 d內統計數據。

2.2.3 愈傷組織誘導

取15 d苗齡的麻瘋樹，子葉和真葉切割為1 cm×1 cm大小，下表面接觸培養基接入培養基上，胚軸橫向切割為1 cm左右長短橫放于培養基上，培養基配方為MS／WPM／N6／LM＋BA1.0mg／L＋IBA0.5mg／L＋TDZ0.1 mg／L，pH 值5.8。每個處理3個重復，每種培養基15～20個外植體，觀察愈傷組織的誘導情況，4周內統計數據。

2.2.4 不定芽的分化

將健康的愈傷組織切成小塊接種到培養基MS／WPM／N6／LM＋BA3.0 mg／L＋IBA0.5 mg／L＋GA31 mg／L上，每個處理3個重復，每個重復15～20個外植體，觀察愈傷組織誘導不定芽的時間、形態、數量等，4周內統計數據。4周后，將叢生的不定芽分成2株一叢，轉接入不定芽誘導培養基，使其繼續增殖。

2.2.5 不定芽的伸長

將健康并且株高在2 cm以下的不定芽，轉入不定芽伸長培養基 MS／WPM／N6／LM＋BA 0.1mg／L＋IBA 0.2 mg／L，每個處理3個重復，每種培養基15～20個外植體，觀察不定芽抽長的長度和長勢等，測量其株高平均值變化，4周內統計數據。

2.2.6 生根誘導

將株高在2.5 cm以上的再生苗接入不添加任何外源植物激素的4種基本培養基上培養一周，降低苗體內激素水平，之后接入培養基1／2（MS／WPM／N6／LM）＋NAA0.5 mg／L＋IBA0.2 mg／L進行生根誘導，每個處理3個重復，每種培養基15～20個外植體。觀察記錄生根的數量、長度、形態，4周內統計數據。

若沒有特別說明，培養條件都是25±2℃，光照周期16 h／d，光照強度3 000lx。

3 結果及結論

3.1 無菌苗的萌發

4種培養基中無菌苗的萌發率都比較高，而且比較健康，推測是因為子葉貯存了一定的營養物質，但是各培養基中無菌苗生長狀況有所不同。N6培養基中的幼胚胚根最先長出，MS和WPM稍晚一些，LM培養基中最晚，各培養基中胚根都比較健康，呈白色，數量一般3～5根。子葉均比較肥厚，脈絡清晰，N6培養基中無菌苗莖干最為粗壯，平均株高最高，真葉出現的時間也較早，第8 d出現第一片真葉，LM依然是最后出現真葉的，但是各培養基中無菌苗長出的真葉，基本無畸形葉，并且葉脈清晰。各培養基中無菌苗萌發情況見表1。

表1 4種培養基中無菌苗萌發情況

3.2 愈傷組織的誘導

接種一周左右，外植體邊緣、末端開始膨大、卷曲，逐漸增厚，顏色漸漸變淺，出現淡黃綠色、淺綠色或者白色疏松、較致密愈傷組織。白色的愈傷組織在后續的培養中容易褐化死亡，不易分化出不定芽；淡黃綠色和淺綠色疏松愈傷組織的不定芽分化率比較低，并且芽苗比較矮小，莖段較細；淺綠色較致密愈傷組織分化不定芽能力比較強，并且在一段時間的培養之后在邊緣有出現芽點。MS和WPM培養基中子葉愈傷組織大多呈淺綠色，較致密，并且出現的芽點較多，有的莖段直接誘導出了小苗，N6培養基和LM培養基中幾乎沒有出現芽點，愈傷組織也不如MS和WPM培養基中的多。4種培養基中外植體愈傷誘導情況見表2。

表2 4種培養基中愈傷誘導情況

3.3 不定芽的誘導

接種一周左右，愈傷組織開始出現隆起，個別隆起會分化出正常的不定芽，其他的隆起或者一直是突起狀態或者形成畸形芽，畸形芽莖干很粗，沒有葉片或者葉片很小容易脫落，可能是由于細胞分裂素濃度太高的原因。4種培養基中，WPM培養基中不定芽分化數量最多，并且平均株高比較高，幼苗葉片翠綠，葉脈清晰，葉形正常，LM培養基中不定芽分化比較少，并且比較弱小（見圖1）。各培養基中不定芽分化情況見表3。

表3 4種培養基中不定芽分化情況

3.4 不定芽抽長誘導

經過抽長培養，各培養基中的組培苗都有一定程度的抽長，4種培養基中不定芽的伸長并沒有很大的差異，都在1 cm左右，可見在抽長培養中，主要起作用的是激素。

3.5 生根誘導

培養2周后，LM和WPM培養基中幼苗最先出現幼根，基本在3條左右。4周后，MS生根率大致為60%，LM和WPM都達到90%以上，N6生根誘導率最低，為34%。LM培養基中幼苗主根發達，粗壯，側根很少；WPM培養基中的幼苗主根數量較少，側根很發達；MS培養基中的幼苗主根短粗，少側根；N6培養基中的主根數量較少，并且比較短，其上有側根的突起（見圖2）。各培養基中不定芽生根情況見表4。

表4 4種培養基中幼苗生根情況

圖1 不定芽的誘導情況

圖2 幼苗生根情況

綜合以上情況，筆者認為在以麻瘋樹無菌萌發苗作為外植體時，WPM培養基更為適合麻瘋樹的組織培養，在各階段的表現都比較穩定。

4 展望

麻瘋樹的組織培養研究現在存在的主要問題在于重復性比較低，難以用于大規模的工廠化生產，缺少一個高效、穩定的再生體系，還需要研究者們進一步的進行研究。麻瘋樹現在已經成為生物能源的研究熱點，但是其低產量仍然是困擾各國學者的一大難題，許多學者在提高其產量方面進行了非常多的研究，今后的研究重點應該是集中在其性別分化機制及雌雄花比例方面，從分子、細胞、組織培養等各種方面研究促進其雌雄花比例升高，以提高結實率，以提高產油量，緩解能源危機。

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