BMS-345541對急性粒細胞白血病細胞DNA損傷修復的影響

田　崛，陳顯凌，莊英婷，范瑩娟，許建華，吳麗賢

(1.福建醫科大學藥學院藥理系，福建福州　350004;2.福建省天然藥物藥理學重點實驗室，福建福州　350004; 3.福建醫科大學新藥研究所，福建福州　350004;4.福建醫科大學附屬協和醫院血液科，福建福州　350001; 5.福建省血液病研究所，福建福州　350001)

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BMS-345541對急性粒細胞白血病細胞DNA損傷修復的影響

田崛1，2，3，陳顯凌4，5，莊英婷1，2，3，范瑩娟1，2，3，許建華1，2，3，吳麗賢1，2，3

(1.福建醫科大學藥學院藥理系，福建福州350004;2.福建省天然藥物藥理學重點實驗室，福建福州350004; 3.福建醫科大學新藥研究所，福建福州350004;4.福建醫科大學附屬協和醫院血液科，福建福州350001; 5.福建省血液病研究所，福建福州350001)

摘要:目的體外研究BMS-345541對急性粒細胞白血病(AML)細胞DNA損傷修復的影響及其可能的作用機制。方法MTT法檢測VP-16作用于AML細胞，加入或不加入BMS-345541對該細胞增殖抑制的影響;流式細胞術檢測BMS-345541對AML細胞DNA損傷修復、細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響;高內涵觀察不同處理組γ-H2AX、p-ATM、RAD51募集在斷裂位點的焦點情況。結果聯合用藥組比單用VP-16組對細胞的增殖抑制作用強;流式檢測加入BMS-345541組比不加入組的γ-H2AX比例高，且加入BMS-345541組能夠抑制VP-16導致的AML細胞G2/M期阻滯，增加細胞的凋亡率;高內涵檢測斷裂位點的p-ATM及RAD51的熒光焦點，6 h后，加入BMS-345541組比修復組的焦點的平均熒光強度和平均熒光面積高。結論VP-16導致AML細胞產生DNA損傷，加入BMS-345541，能通過抑制HR通路來抑制細胞DNA損傷修復。

關鍵詞:IKKβ; BMS-345541; DNA損傷;γ-H2AX; p-ATM; RAD51

當前臨床治療腫瘤常用的放射治療及絕大多數抗腫瘤藥物的共同作用機制是損傷DNA。損傷DNA的分子機制不盡相同，常見的DNA損傷類型有單鏈斷裂(SSD)，雙鏈斷裂(DSB)，堿基損傷(base damage)，群集病變(clustered lesions)。主要可以通過以下6條修復通路予以修復:同源重組(homologous recombination，HR)，非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)，堿基切除修復(base excision repair，BER)，核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)，錯配修復(mismatch repair)和跨損傷修復(direct reversal)［1］。在DNA的損傷中，雙鏈斷裂是最嚴重的，主要通過HR和NHEJ進行修復。DNA修復能力異常激活和增強是導致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎;相反，修復缺陷則使腫瘤對其高度敏感。因此，尋找DNA修復抑制劑成為抗腫瘤研究領域的一項新熱點。

IKKβ是IKK復合體中的一個催化亞基，通過經典途徑激活核轉錄因子(NF-κB)，在免疫應答、炎癥反應過程中發揮重要作用［2］。經典的IKK/NF-κB的激活途徑是: IKK磷酸化IκBα，磷酸化的IκBα被泛素化降解，釋放游離的p65，與p50結合形成p65-p50的二聚體進入核內，結合到DNA的κB序列，啟動下游的基因轉錄，介導細胞的增殖、轉移、抗凋亡。最近的有研究表明:在乳腺癌、胃癌和宮頸癌細胞中，IKKβ與DNA雙鏈損傷修復密切相關，且是非依賴于經典的IKKβ/NF-κB途徑［3－4］。隨后又證實抑制IKKβ可通過抑制HR修復來抑制乳腺癌細胞的DNA雙鏈斷裂修復［5］。

本課題使用的依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物，可誘導白血病細胞產生DNA雙鏈損傷，臨床上廣泛用于治療急性粒細胞白血病(AML)等惡性腫瘤。BMS-345541是IKKβ的新型選擇性抑制劑［6］。研究顯示，BMS-345541在體外和體內模型中，均可有效地抑制IKKβ活性，減少NF-κB及其調節的炎癥因子的表達。本實驗旨在探討VP-16導致AML細胞產生DNA損傷后，用BMS-345541抑制IKKβ能否抑制細胞的DNA損傷修復進而增敏VP-16對AML的療效。

1　材料與方法

1.1材料BMS-345541購于美國Selleck Chemicals公司，溶解于ddH2O中，配成儲存液20 mmol· L－1于－20℃備用，使用前解凍，用培養液稀釋成所需濃度。VP-16注射液購于齊魯制藥有限公司，濃度為34 mmol·L－1，使用前用培養液稀釋成所需濃度。Hyclone RPMI1640培養基和Hyclone胎牛血清均購于Thermo Scientific。MTT［3-(4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴鹽］購置于美國Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成5 g·L－1存儲液，小劑量分裝，－20℃避光儲存。γ-H2AX單克隆抗體購置于Cell Signaling Technology公司，p-ATM，RAD51單克隆抗體均購置于Abcam公司，羊抗兔IgG-HRP二抗購于凱基生物公司。DNA損傷試劑盒購于BD公司。流式凋亡檢測試劑盒均購自瑞士Roche公司。RNA酶和碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司。酶標儀Microplate Reader 450購于美國BIO-RAD公司; BD FACSCantoⅡ流式細胞儀購于BD公司;高內涵購于Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養HL-60細胞和KG1a細胞采用含0.1的胎牛血清RPMI 1640，青霉素(100 000 IU ·L－1)和鏈霉素(50 mg·L－1)，在37℃、5 %的CO2孵育箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組與處理實驗分組如下:對照組: RPMI 1640培養基;損傷組: VP-16處理2 h;修復組: VP-16處理細胞2 h后洗掉藥物繼續培養6 h;聯合用藥組: VP-16處理2 h后洗掉藥物加入BMS-345541繼續培養6 h; BMS組: BMS-345541處理組(6 h)。

1.2.3MTT法檢測藥物對細胞的增殖抑制作用

取對數生長期的白血病細胞HL-60和KG1a，按5× 107·L－1接種于96孔培養板中，每孔180 μL。實驗組分別加入不同濃度的藥物20 μL，對照組不加藥物，另設背景對照，每組設3個平行孔，37℃培養24 h。加入5 g·L－1的MTT溶液，每孔20 μL，繼續培養4 h后，離心棄上清，加入150 μL DMSO，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標儀在570 nm波長處測吸光度(OD值)。根據吸光度計算細胞生長抑制率［細胞生長抑制率/%=(對照組OD－實驗組OD)/對照組OD×100%］。以藥物濃度為橫軸，抑制率值為縱軸繪制細胞增殖抑制量效關系曲線。

1.2.4流式檢測細胞DNA損傷的情況取對數生長期HL-60細胞，按分組要求用藥物處理后，收集細胞，以800 r·min－1離心5 min，棄上清，PBS洗滌，固定，破膜，DNase處理1 h，加入anti-H2AX熒光探針室溫孵育20 min(按DNA損傷試劑盒說明書操作)。轉入到流式管中，上機檢測。

1.2.5碘化丙啶染色法檢測細胞周期的步驟取對數生長期的HL-60細胞，計數，調整細胞最終濃度為4×108·L－1，每孔2 mL，接種到6孔板中，按分組要求加藥處理后，收集細胞，800 r·min－1，離心5 min。用PBS洗滌細胞1次，收集細胞，用0.1 mL PBS重懸。取1 mL預冷的體積分數為0.75的乙醇，將0.1 mL的細胞液緩慢地加入其中，輕輕混勻。4℃放置冷卻后，轉移到－20℃冰箱中放置24 h以上。待檢測時，離心棄去乙醇，用PBS洗滌1次，加入PI染色液(50 mg·L－1) 0.1 mL，加入RNA酶，使其終濃度為50 mg·L－1。室溫避光染色30 min后轉移入流式管中，4℃避光，冰上保存，并在流式細胞儀上檢測。

1.2.6Annxin-V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡實驗步驟取對數生長期的HL-60細胞，計數，調整細胞最終濃度為4×108·L－1，每孔2 mL，接種到6孔板中，按分組要求加藥處理后，收集細胞，800 r· min－1，離心5 min。用PBS洗滌細胞兩次，收集細胞。加入500 mL的Binding Buffer重懸細胞。每組中加入5 μL的Annxin-V-FITC混勻后，再加入5 μL 的PI，混勻。室溫避光反應15 min。轉移入流式管中，4℃避光，冰上保存，流式細胞儀檢測。

1.2.7高內涵檢測γ-H2AX、p-ATM、RAD51在斷裂位點的聚集情況取對數生長期的HL-60細胞，計數，調整細胞最終濃度為4×108·L－1，每孔8 mL，接種到大培養皿中，加藥處理后，收集細胞，800 r·min－1，離心5 min。用PBS洗滌細胞兩次，收集細胞，固定，破膜，封閉，一抗孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗避光孵育30 min，PBS洗滌3次，加DAPI避光孵育15 min，洗滌后用PBS重懸，調整細胞濃度為2×108·L－1，每孔0.1 mL，接種到96孔板中，平板離心機1 000 r·min－1，離心5 min。上機檢測。

2　結果

2.1聯合用藥組比單藥組對AML細胞的增殖抑制作用強單藥組:用不同濃度的VP-16處理HL-60和KG1a細胞;聯合用藥組:用VP-16處理細胞2 h后洗掉藥物，再加入不同濃度的BMS-345541。24 h后，MTT法檢測，結果采用GraphPad Prism 5軟件分析，可以明顯看出聯合用藥組的抑制率比單藥組的抑制率高(Fig 1)。

Fig 1 Proliferation inhibition of HL-60 and KG1a with BMS-345541 and VP-16 treatments

2.2AML細胞產生DNA損傷后，BMS-345541可抑制其DNA損傷修復H2AX的磷酸化是DSBs發生后最早期的事件之一，損傷發生后幾分鐘，細胞核內就能檢測到散在的γ-H2AX。目前，γ-H2AX的水平已經成為公認的DSBs發生早期的標志［7］。不同處理組處理HL-60細胞，流式檢測γ-H2AX的比例(Fig 2)，高內涵檢測各組γ-H2AX焦點的平均熒光面積和平均熒光強度(Fig 3)。對比高內涵和流式結果可知，對照組γ-H2AX的比例極少，VP-16處理細胞2 h的損傷組含量最多，而修復6 h后，其比例下降，DNA損傷減少，聯合用藥組γ-H2AX的含量比修復組高，且差異有顯著性(P＜0.01)。提示: AML細胞產生DNA損傷后，BMS-345541可抑制其DNA損傷修復。

Fig 2 FCM tested effect of BMS-345541 onrepair of DNA DSBs in AML cells

2.3BMS-345541抑制DNA損傷修復與p-ATM的關系用高內涵檢測斷裂位點p-ATM的焦點情況，由高內涵所得數據可知(Fig 4) :聯合用藥組的p-ATM焦點的平均熒光面積和平均熒光強度比修復組高(P＜0.01) ;由高內涵所得圖片可知:聯合用藥組的紅色熒光(p-ATM)比修復組高(P＜0.01)。說明: VP-16作用于AML細胞后產生DNA損傷，BMS-345541抑制其DNA損傷修復可使斷裂位點p-ATM焦點增多，使其停留在DNA損傷應答階段。

2.4AML細胞產生DNA損傷后，BMS-345541抑制細胞G2/M期阻滯，增加細胞凋亡不同組處理HL-60細胞，PI染色流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示: VP-16作用于AML細胞后會導致其產生G2/M期阻滯，加入BMS-345541后，隨著其藥物濃度的增加，G2/M期阻滯逐漸變弱。且呈劑量依賴性關系。PI和Annexin V-FITC雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，結果提示:聯合用藥組與VP-16組比凋亡率高(P＜0.05)。

2.5BMS-345541抑制DNA損傷修復與RAD51的關系同源重組修復是最重要的修復機制之一，主要在S期和G2后期被激活［8］。而RAD51是同源重組修復的中心分子，主要催化斷裂的DNA雙鏈與完整的同源DNA姐妹鏈進行鏈間轉移置換［9］。當DNA出現雙鏈斷裂時，RAD51蛋白的表達增高，并在斷裂位點募集形成多個核灶區。用高內涵檢測斷裂位點RAD51的焦點情況，由各組焦點的平均熒光面積和平均熒光強度可知(Fig 6) :聯合用藥組的RAD51焦點比修復組多(P＜0.01)。說明: AML細胞產生DNA損傷后，加入BMS-345541組，RAD51焦點在斷裂位點的聚集未能散去而持續存在，說明細胞停留在DNA損傷應答階段，HR通路被抑制，從而抑制細胞DNA損傷修復。

Fig 3 HCA tested the effect of BMS-345541 on repair of DNA DSBs in AML cells

Fig 4 Relationship between p-ATM and BMS-345541 inhibited repair of DNA DSBs

Fig 5 BMS-345541 inhibite?d cell cycle G2/M phase arrest and increased apoptosis ratio

Fig 6 Relationship between RAD51 and BMS-345541 inhibited the repair of DNA DSBs

3　討論

AML是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病，其克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發育的不同階段。白血病細胞在骨髓和其他造血組織中大量增生、積聚，并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受到抑制，臨床表現為出血、貧血、感染及各器官浸潤癥狀。其臨床治療，仍然采用傳統的細胞毒藥物，大部分在接受化療后病情會緩解，但停藥后易復發。而DNA修復能力的異常激活和增強是導致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎，所以，尋找DNA損傷修復抑制劑成為抗腫瘤研究領域的一項新的熱點。

本研究發現，VP-16導致AML細胞產生DNA損傷，若不加入BMS-345541，則細胞將進行自我修復，6 h后γ-H2AX、p-ATM、RAD51在斷裂位點的焦點逐漸散去，修復基本完成;而加入BMS-345541抑制IKKβ后，斷裂位點的γ-H2AX、p-ATM、RAD51焦點持續存在，與修復組比差異有顯著性，說明DNA損傷修復被抑制。

ATM作為DNA損傷信號傳導通路中最早的傳感和中樞調控基因，當DNA損傷時，信號傳導通路中的上游基因ATM能夠感受DNA損傷信號，在每個斷裂部位產生大量的p-ATM。DNA損傷修復分為兩部分: DNA損傷應答和DNA損傷修復。當聯合用藥組p-ATM在斷裂位點的焦點增多說明DNA損傷信號持續高表達，處于DNA損傷應答階段，DNA損傷未被修復。同源重組修復是DNA雙鏈損傷的主要修復方式，對于保持哺乳動物細胞的基因組完整性十分重要［10］。已有研究指出，與正常的細胞相比較，腫瘤細胞可以優先依賴HR通路修復DNA雙鏈斷裂［11］。RAD51是HR的中心分子，它參與DNA損傷感應和細胞周期關卡的復雜信號通路。若細胞完成修復(如修復組)，RAD51在斷裂位點的聚集將解散，而持續存在則說明細胞始終停留在DNA損傷的應答階段，未進行DNA損傷修復。HR通路被抑制。

細胞在遭受DNA損傷時，會激活DNA損傷應答反應，如使損傷細胞周期發生阻滯為細胞啟動DNA損傷修復提供時間。從本實驗數據可以看出，VP-16作用于AML細胞產生DNA損傷后，周期阻滯在G2/M期，而當加入IKKβ抑制劑BMS-345541后，隨著藥物濃度的增加，G2/M期的阻滯逐漸被抑制，從而使損傷細胞沒有足夠的時間進行DNA損傷修復。然而，HR修復主要在S期和G2后期被激活，G2/M期阻滯抑制也使HR修復不能被激活。流式細胞術檢測凋亡也顯示IKKβ抑制后，能增加VP-16對AML的敏感性，使其凋亡率增高。

4　結論

VP-16導致AML細胞產生DNA損傷后，加入BMS-345541，通過抑制HR通路抑制細胞DNA損傷修復。

(致謝:本實驗在福建省天然藥物藥理學重點實驗室、福建醫科大學新藥研究所完成。)

參考文獻:

［1］Aziz K，Nowsheen S，Pantelias G，et al.Targeting DNA damage and repair: embracing the pharmacological era for successful cancer therapy［J］.Pharmacol Ther，133(3) : 334－50.

［2］王曉璐，方玉春，李靜.IKKβ結構與功能及其抑制劑研究進展［J］.中國藥理學通報，2012，28(2) :158－61.

［2］Wang X，Fang Y，Li J.On structure and functions of IκB kinaseβ and development of its inhibitors［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2) :158－61.

［3］Wu L，Shao L，An N，et al.IKKb Regulates the repair of DNA double-strand breaks induced by ionizing radiation in MCF-7 breast cancer cells［J］.PLoS ONE，2011，6(4) : e18447.

［4］Sakamoto K，Hikiba Y，Nakagawa H，et al.Promotion of DNA repair by nuclear IKKb phosphorylationof ATM in response to genotoxic stimuli［J］.Oncogene，(2013) 32，1854－62.

［5］Wu L，Shao L，Li M，et al.BMS-345541 sensitizes MCF-7 breast cancer cells to ionizing radiation by selective inhibition of homologous recombinational repair of DNA double-strand breaks［J］.Radiat Res，2013，179(2) :160－70.

［6］Burke J R，Pattoli M A，Gregor K R，et al.BMS-345541 is a highly selective inhibitor of I kappa B kinase that binds at an allosteric site of the enzyme and blocks NF-kappa B-dependent transcription in mice［J］.J Biol Chem，2003，278:1450－6.

［7］Zhang T，Tan Y，Zhao R，Liu Z.DNA damage induced by oridonin involves cell cycle arrest at G2/M phase in human MCF-7 cells ［J］.Wspolczesna Onkol，2013，17(38－44) :10.5114.

［8］Rothkamm K，Kruger I，Thompson L H，Lobrich M.Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle ［J］.Mol Cell Biol，2003，23:5706－15.

［9］彭亞婷，梅金紅.RAD51與腫瘤關系的研究進展［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27(1) :86－9.

［9］Peng Y T，Mei J H.Advances of the relationship between RAD51 and cancer research［J］.Chin J Clin Exp Pathol，2011，27(1) :86 －9.

［10］Valerie K，Povirk L F.Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair［J］.Oncogene，2003，22:5792－812.

［11］Yang J，Amiri K I，Burke J R，et al.BMS-345541 targets inhibitor of kappaB kinase and induces apoptosis in melanoma: involvement of nuclear factor kappaB and mitochondria pathways［J］.Clin Cancer Res，2006，12:950－60.

BMS-345541 regulates repair of DNA double-strand breaks induced by VP-16 in acute myeloid leukemia cells

TIAN Jue1，2，3，CHEN Xian-ling4，5，ZHUANG Ying-ting1，2，3，FAN Ying-juan1，2，3，XU Jian-hua1，2，3，WU Li-xian1，2，3
(1.Dept of Pharmacology，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China; 2.Key Laboratory of Natural Drug Pharmacology in Fujian Province，Fuzhou 350004，China; 3.Institute of Material Medica，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China;4.Dept of Hematology，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，China;5.Institute of Hematology in Fujian Province，Fuzhou 350001，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of BMS-345541 on the repair of DNA DSBs induced by VP-16 in AML cells and its possible mechanism.Methods The effects of BMS-345541 on the sensitivity of AML cells to VP-16 were determined by MTT.Flow cytometry (FCM) was applied to test the level of DNA damage，cell cycle progression and apoptosis in AML cells.High content analysis (HCA) was used to verify the amount of γ-H2AX，p-ATM，RAD51 in AML cells.ResultsBMS-345541 could significantly inhibit the proliferation of AML cells induced by VP-16.BMS-345541increased the amount of RAD51 foci and p-ATM foci in AML cells treated with VP-16 after 6 hours，which led to increased numbers of cells in the G2/M phases of the cell cycle，then induced apoptotic cell death.Conclusion BMS-345541 sensitizes AML cells to VP-16 via selective inhibition of homologous recombinational repair of DNA double-strand breaks.

Key words:IKKβ; BMS-345541; DNA damage;γ-H2AX; p-ATM; RAD51

作者簡介:田崛(1990－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤藥理學，E-mail: amyjue628@163.com;陳顯凌(1980－)，男，博士，主治醫師，研究方向:血液學，共同第一作者，E-mail:315561399@ qq.com;吳麗賢(1975－)，女，博士，副教授，博士生導師，研究方向:腫瘤藥理學，通訊作者，E-mail: 18259000966 @ 126.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 30901824，81173096，81273541) ;福建省自然科學基金杰出青年項目(No 2011J06013) ;福建省高?？缡兰o優秀人才項目(No JA11101)

收稿日期:2015－01－30，修回日期:2015－03－10

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0763－07中國圖書分類號: R329.24; R329.25; R329.28; R342.3; R733.720.22

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.006