PJ34對肺腺癌順鉑耐藥細胞增殖及耐藥性的影響

姚圓圓，郝吉慶

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，安徽合肥　230022)

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PJ34對肺腺癌順鉑耐藥細胞增殖及耐藥性的影響

姚圓圓，郝吉慶

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，安徽合肥230022)

摘要:目的探討第3代選擇性PARP-1抑制劑PJ34對肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP生長活性及耐藥性的影響。方法使用不同濃度梯度的順鉑(DDP)、PJ34單藥或聯合作用于A549/DDP細胞，MTT法檢測各藥物對細胞的增殖抑制率;流式細胞術檢測細胞凋亡率; Western blot檢測細胞內PARP-1蛋白、MDR相關蛋白(LRP、GST-π)的表達水平。結果PJ34單藥對A549/DDP細胞有明顯的抑制作用，無毒劑量的PJ34可明顯增強A549/DDP細胞對順鉑的敏感性，誘導細胞凋亡，使細胞內PARP-1蛋白、MDR相關蛋白(LRP、GST-π)的表達水平明顯降低。結論A549/DDP細胞的順鉑耐藥性與細胞內PARP-1蛋白的過度表達有關，PJ34有明顯的順鉑增敏作用，能部分逆轉A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性，其機制可能與誘導細胞凋亡，降低細胞內LRP、GST-π的蛋白表達水平有關。

關鍵詞:肺腺癌;聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1抑制劑;順鉑;耐藥性;凋亡;機制

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種廣泛存在于真核細胞核中的蛋白質翻譯后修飾酶，PARP-1是其主要成員，發揮著90%以上的功能，在DNA損傷修復、基因組完整性的維持、細胞死亡、有絲分裂中紡錘體的形成等過程中發揮關鍵作用［1－3］。國內外學者們對PARP-1抑制劑在惡性腫瘤治療中的作用進行了長期大量的探索和研究。目前，PARP-1抑制劑已發展到第3代，其選擇性、活性更高，并且很多已進入臨床試驗階段，被認為是一種新型有效的抗腫瘤藥物。PARP-1抑制劑在乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中的體內外Ⅲ期臨床試驗中均取得了良好的療效［4－5］，但在肺癌中的研究仍較少。目前研究發現，肺癌的發病率及死亡率均位居全球惡性腫瘤之首，在我國更是威脅人類生命健康的最大殺手。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌發病率的75%～80%，絕大多數(80%)確診時已屬晚期，失去手術機會，化學治療成為晚期NSCLC的主要治療方法。順鉑(cisplatin，DDP)是臨床上最常用的細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，主要作用靶點是DNA，通過在細胞內形成鉑-DNA加合物抑制DNA的復制和轉錄，目前以DDP為基礎的聯合化療仍是國際上公認的晚期NSCLC的標準一線化療方案。然而，絕大多數患者在DDP用藥過程中會逐步產生耐藥現象，導致腫瘤復發及治療失敗。這成為當前困擾肺癌治療的一大難題。肺癌的DDP耐藥機制是一個多因素參與的復雜過程［6］，至今仍未明確。因此，探索肺癌DDP耐藥機制的決定因素、尋求耐藥逆轉劑來克服耐藥現象成為當前臨床治療肺癌急需解決的問題。

本研究擬探討第3代PARP-1抑制劑PJ34對肺癌A549/DDP細胞耐藥性的影響，初步探究其可能的作用機制，為PARP-1抑制劑應用于肺癌DDP耐藥的臨床治療提供一定的依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株A549/DDP細胞株購自上海瑞鹿生物科技有限公司，A549細胞株由安徽醫科大學第一附屬醫院中心實驗室惠贈，均培養于37℃、5% CO2的培養箱中，隔天換液，細胞長滿80%～90%即可傳代。A549/DDP細胞培養液中加入終濃度為2 mg·L－1的順鉑以維持耐藥表型。

1.1.2藥品與試劑RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司，PJ34、胎牛血清、MTT粉末均購自美國Sigma公司，順鉑注射液購自山東齊魯制藥廠，Annecxin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物公司，兔抗人PARP-1單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗人LRP單克隆抗體購自Santa Cruz公司，鼠抗人GST-π單克隆抗體購自Bioworld公司，ECL發光試劑盒購自Thermo公司。

1.1.3主要儀器設備細胞培養箱購自美國THERMO公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，超凈工作臺購自蘇州凈化，低速離心機購自德國Eppendorf，流式細胞儀購自美國Beckman公司，EPS300型電泳儀、VE-186型轉膜儀均購自Tanon公司。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測DDP及PJ34單藥對A549/DDP細胞增殖的影響將對數生長期的細胞以5 000 個/孔接種于96孔板，分別設空白對照組、細胞對照組及藥物處理組，培養于37℃、5% CO2的培養箱中，次日上午分別按DDP(10、20、30、40、50 mg· L－1)、PJ34(3、6、12、24、48、96 mg·L－1)梯度加藥。繼續培養48 h，每孔加入MTT溶液(5 g·L－1) 20 μL，再繼續培養4 h，小心棄去孔中液體，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL，自動酶標儀測定490 nm波長處每孔吸光度(A值)，并計算抑制率。抑制率/%=［1－(處理組平均A值－空白對照組平均A值)/(細胞對照組平均A值－空白對照組平均A 值)］×100%。最后用SPSS 19.0軟件計算各藥物的半數抑制濃度IC50。實驗重復3次。

1.2.2MTT法檢測PJ34聯合DDP對A549/DDP細胞增殖的影響將對數期的細胞接種于96孔板，37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養，次日上午加入無毒劑量的PJ34(3 mg·L－1)與不同濃度DDP(10、20、30、40、50 mg·L－1)聯合作用48 h，加入MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，自動酶標儀測定490nm波長處每孔吸光度(A 值)，并計算抑制率。SPSS軟件計算兩藥聯合時DDP的IC50，并計算PJ34對DDP的逆轉倍數(RF)及相對逆轉率(RRR%)。

RF＞1表示逆轉劑PJ34能增強DDP的作用，RF=1表示兩藥無交互作用，RF＜1表示拮抗作用，RF越大，說明逆轉效果越好。RRR%≥100%，表示完全逆轉作用; RRR%＜100%，表示部分逆轉作用。

1.2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡分別設對照組、PJ34單藥組(3 mg·L－1)、DDP單藥組(12 mg·L－1)及聯合用藥組(PJ34 3 mg·L－1+ DDP12 mg·L－1)。藥物處理48 h后，根據試劑盒說明收集細胞，用400 μL Annexin V-FITC結合液重懸，加入5 μL Annexin V染色15 min，再加入10 μL PI染色5 min。1 h內流式細胞儀上機檢測。散點圖左下象限散點顯示活細胞，右上象限散點顯示早期凋亡細胞，右下象限散點顯示晚期凋亡及壞死細胞，左上象限散點顯示機械損傷細胞。

1.2.4Western blot法檢測蛋白表達取對數期A549親本株及A549/DDP耐藥株接種于培養瓶內，分別設A549組、A549/DDP組、PJ34處理組(3 mg ·L－1)、DDP處理組(12 mg·L－1)及聯合用藥組(PJ34 3 mg·L－1+ DDP 12 mg·L－1)。藥物處理48 h后，棄上清，裂解細胞提取蛋白，－80℃保存。反復凍融3次后，BCA法進行蛋白定量。配制SDSPAGE凝膠，取等量的蛋白質樣本進行上樣分離并轉移至PVDF膜上，封閉。加入相應一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜。ECL試劑盒顯色，X膠片曝光。

1.2.5統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行處理。實驗數據用±s表示。兩組以上的數據比較采用方差分析，兩組間數據比較采用t檢驗。

2　結果

2.1A549/DDP耐藥株與A549敏感株對DDP的敏感性A549/DDP細胞對DDP的耐藥性明顯高于A549細胞。DDP單藥處理48 h后的IC50分別為: A549敏感株(2.49±0.39) mg·L－1，A549/DDP耐藥細胞(26.14±0.62) mg·L－1，與敏感株相比，耐藥倍數為10.5倍(Tab 1)。

Tab 1 Sensitization of A549 and A549/DDP cells to DDP(珋±s，n=3)

Tab 1 Sensitization of A549 and A549/DDP cells to DDP(珋±s，n=3)

DDP/mg·L－1　A549/%　DDP/mg·L－1A549/DDP/% 0.625　14.88±1.67　10　19.23±0.83 1.25　38.88±1.84　20　35.83±1.45 2.5　63.19±5.4　30　59.91±2.08 5 80.46±4.88　40　77.91±0.41 10　92.26±2.46　50　87.83±0.8

2.2不同濃度的PJ34單藥對A549/DDP細胞增殖的影響PJ34單藥對A549/DDP細胞的生長也有抑制作用，抑制率隨藥物濃度的增加而增加。用SPSS19.0軟件計算，PJ34處理A549/DDP細胞48 h其半數抑制濃度(IC50)為(22.2±2.09) mg·L－1。并且，3 mg·L－1的PJ34對A549/DDP細胞的抑制率為4.43%，抑制率＜5%，可認為是該藥物的無細胞毒濃度(Fig 1)。

2.3無毒濃度的PJ34聯合DDP可明顯增強A549/DDP細胞對DDP的敏感性與DDP單藥組相比，無毒濃度(3 mg·L－1)的PJ34聯合DDP組A549/DDP細胞對順鉑的敏感性明顯增加，IC50值由(26.14±0.62) mg·L－1降低為(11.46±0.92) mg ·L－1(P＜0.01)，逆轉倍數(RF)為2.28倍，相對逆轉率(RRR%)為62.7%，提示PJ34具有部分逆轉A549/DDP細胞DDP耐藥的作用(Fig 2)。

Fig 1 Inhibition ratios of PJ34 on growth of A549/DDP cellss，n=3)

Fig 2 Inhibition ratios of DDP alone or combined with PJ34on growth of A549/DDP cells(珋±s，n=3)

2.4DDP單藥/聯合PJ34對A549/DDP細胞凋亡的影響3 mg·L－1(無毒濃度)的PJ34對A549/DDP細胞無明顯殺傷作用，凋亡率與對照組相比，P ＞0.05，差異無統計學意義。12 mg·L－1(IC50)的DDP單藥對A549/DDP細胞有一定的細胞毒作用，凋亡率為17.74%，與對照組相比，P＜0.05，差異有統計意義。而PJ34與DDP聯合可明顯誘導細胞凋亡，凋亡率為33.2%，與PJ34單藥及DDP單藥組相比，P＜0.05(Fig 3，Tab 2)。

Fig 3 Apoptosis ratios of PJ34 alone or combined withDDP on A549/DDP cells

Tab 2 Apoptosis rate of A549/DDP cells treated with PJ34 alone or combined with DDP±s，n=3)

Tab 2 Apoptosis rate of A549/DDP cells treated with PJ34 alone or combined with DDP±s，n=3)

*P＜0.05 vs control;ΔP＜0.05 vs PJ34 and DDP.

Group　Apoptosis rate/% Control　7.35±2.12 PJ34　9.46±1.8 DDP　18.02±3.57*PJ34+ DDP　34.76±3.81Δ

2.5PJ34單藥及聯合順鉑對細胞內PARP-1、LRP、GST-π蛋白的調節作用采用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，結果見Fig 4、5，圖中數據均為樣本蛋白表達/β-actin表達。A549/DDP耐藥株內PARP-1及耐藥相關蛋白LRP、GST-π的表達水平均較A549順鉑敏感株明顯升高。PJ34聯合DDP處理48 h后，A549/DDP耐藥株內PARP-1及LRP、GST-π的表達水平均明顯下降，與A549/DDP細胞對照組及單藥處理組相比，P＜0.05，差異有統計學意義。

3　討論

肺癌的順鉑耐藥性是造成化療失敗的主要原因之一，其耐藥機制至今仍是讓人倍感困惑的問題。目前關于肺癌耐藥相關蛋白研究較多的主要有肺耐藥相關蛋白(lung resistancerelated protein，LRP)和谷胱甘肽-S-轉移酶-π(glutathione S-transferase-Pi，GST-π)等。LRP主要通過2種機制引起多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，一是阻止以細胞核為靶點的藥物通過核孔進入核內，并將進入的藥物在藥效發生前泵出核外;二是使胞質中的藥物進入囊泡，然后通過胞吐作用排出細胞［7］。LRP在腫瘤組織中含量明顯增高，可明顯影響抗癌藥物的胞內的轉運和分布，介導鉑類、烷化劑等耐藥。GST是一組具有解毒和抗氧化作用的酶類，其中GST-π的表達在人類腫瘤細胞中明顯增高，與耐藥關系最密切，DDP等抗癌藥物都是通過該系統被運送至胞外［8］。Bai等［9］曾經報道NSCLC患者組織中GST-π表達與順鉑的化療有效率呈明顯負相關，說明了GST-π是介導肺癌DDP耐藥的重要因素之一。在本研究中，我們發現A549/DDP耐藥株的LRP、GST-π蛋白表達水平均較A549敏感株明顯升高，與上述文獻報道相符，本研究補充了PARP-1抑制劑聯合DDP降低A549/DDP耐藥株的LRP、GST-π蛋白表達水平，從而逆轉耐藥的研究。

PARP-1抑制劑的抗腫瘤作用機制主要是基于PARP-1的DNA損傷修復功能，如果PARP-1的活性被抑制，DNA單鏈損傷(single strand break，SSBs)不能得到及時修復，將導致DNA單鏈損傷的累積，并轉化成持續的雙鏈損傷(double strand break，DSBs)，最終細胞死亡［10］。最初，PARP-1抑制劑作為化療或放療增敏劑，與細胞毒性化療藥物或放療聯合應用［11－13］。Nguewa等［14］通過體外實驗觀察到，無毒劑量的PARP-1抑制劑3-AB與DDP聯合作用于卵巢癌順鉑耐藥細胞株CH1cisR 24 h，不僅能明顯增加耐藥細胞對DDP的敏感性，并能將細胞死亡的方式由壞死轉變為凋亡，從而避免因細胞壞死對機體產生的不良反應。Michels等［15］研究發現與野生型A549細胞相比較，DDP耐藥細胞株對PARP抑制劑更加敏感，當給予野生型A549細胞一定量的DDP后，細胞內PARP-1的表達水平明顯增加，此現象可被PARP抑制劑完全抑制。本研究同樣觀察到PARP-1抑制劑PJ34能明顯增加肺腺癌A549/DDP耐藥細胞對DDP的敏感性，誘導細胞凋亡，提示這可能與其對凋亡通路的調控有一定的相關性。

Fig 4 Protein expression of PARP-1 and LRP，GST-π in A549 and A549/DDP cells(珋±s，n=3)

Fig 5 Protein expression level of PJ34 alone or combined withDDP on A549/DDP cells(珋±s，n=3)

PJ34是第3代選擇性PARP-1抑制劑，屬于菲啶酮類化合物，口服和注射給藥生物利用度都很高。其抑酶活性是傳統PARP抑制劑3-AB的10 000倍。Gangopadhyay等［16］研究發現PJ34單藥即可抑制NSCLC細胞系Calu-6、A549及H460的增殖與轉移，并能通過激活Caspase介導的細胞凋亡通路促進細胞凋亡。本文研究結果與其一致，還檢測了PJ34對A549/DDP耐藥細胞的增殖抑制作用。此外還有文獻［17］顯示: NSCLC細胞對DDP的敏感性與鉑-DNA加合物的累積正相關，PARP抑制劑PJ34具有放緩鉑-DNA加合物清除速度的能力，從而起到DDP增敏作用。

綜上所述，本研究說明PARP-1抑制劑PJ34單藥可抑制A549/DDP細胞的增殖，在無細胞毒作用的低劑量(3 mg·L－1)下，PJ34可明顯增強A549/DDP細胞對DDP的敏感性，部分逆轉耐藥現象，其逆轉機制可能與誘導細胞凋亡、降低細胞內PARP-1蛋白及多藥耐藥蛋白LRP、GST-π的表達水平有關，其具體作用機制有待進一步地深入研究，期望能為DDP耐藥的NSCLC患者的治療提供一定的指導意義。

(感謝安徽醫科大學第一附屬醫院中心實驗室的支持與幫助。)

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Study of reversal effect of PARP-1 inhibitor PJ34 on cisplatin-resistance in human lung adenocarcinoma cells

YAO Yuan-yuan，HAO Ji-qing
(The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China)

Abstract:AimTo investigate the reversal effect of PARP-1 inhibitor PJ34 on cisplatin-resistance in human lung adenocarcinoma A549/DDP cells and the mechanism.Methods A549/DDP cells were treated with PJ34 alone or combined with cisplatin.The effects of proliferation inhibition were assayed by MTT method.The apoptosis ratios of cells were analyzed by flow cytometry.The protein expression of PARP-1 and LRP，GST-π were measured by Western blot assay.Results

PJ34 could inhibit the proliferation of A549/DDP cells alone.The non-toxic dose of PJ34 could significantly resensitize A549/DDPcellstocisplatin，induceapoptotic，lower the expression of PARP-1 and resistance-associated protein LRP and GST-π.Conclusion

PJ34 could inhibit the proliferation of A549/DDP cells and resensitize A549/DDP cells，partially reverse cisplatin-resistance in A549/DDP cells，with a probable mechanism relating to increased apoptotic rate，and lowered expression of PARP-1 and resistance-associated protein LRP and GST-π.

Key words:lung adenocarcinoma; PARP-1 inhibitors; cisplatin; drug resistance; apoptosis; mechanism

作者簡介:姚圓圓(1988－)，女，碩士生，研究方向:胸部腫瘤的個體化治療，E-mail: yao18955179781@163.com;郝吉慶(1969－)，女，博士，副教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向:胸部腫瘤的個體化治療，E-mail: ayfy_hjq@ 163.com

基金項目:安徽省自然科學基金計劃項目(No 1308085MH142) ;安徽省對外科技合作計劃項目(No 1503062023)

收稿日期:2015－01－14，修回日期:2015－03－19

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0865－06中國圖書分類號: R329.24; R730.53; R734.202.2; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.025