杜仲葉中總黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化

羅飛華，楊 莉，張 萍，杜惠蓉

（1.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州635000；2.“特色植物開發(fā)研究”四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 達(dá)州635000）

1 引言

杜仲（EucommiaulmoidesOliver）是中國名貴滋補(bǔ)藥材，主要分布在秦嶺以南的山地［1，2］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲具補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓、安胎等諸多功效，其藥用歷史悠久，在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［3，4］。中國藥典規(guī)定其樹皮作為中藥杜仲入藥，隨著需求量的日益增加，杜仲皮資源緊張。近來研究表明杜仲葉不僅與皮含有相似的有效成分，而且藥理作用也相同［5～8］。因此研究和開發(fā)杜仲葉資源在傳統(tǒng)中藥材保護(hù)及可持續(xù)發(fā)展方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文采用超聲波提取法對(duì)杜仲葉中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，研究杜仲葉中總黃酮的最佳提取工藝，為杜仲葉中有效成分的提取提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與儀器

2.1 主要儀器

UV-2500型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；KH-3200B型超聲清洗儀（昆山禾創(chuàng)）；HK-02A型手提中草藥粉碎機(jī)（廣州旭朗）；FA1004型電子分析天平（上?；ǔ保?；5418小型高速離心機(jī)（德國艾本德）；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣）；8目的篩子。

2.2 主要試劑

新鮮杜仲葉（采摘于四川萬源）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心）、無水乙醇（AR）、亞硝酸鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、氫氧化鈉（AR）等；二次蒸餾水。

3 實(shí)驗(yàn)過程

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用天平精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品41.8mg置于25mL的小燒杯，在攪拌狀態(tài)下分多次加入總體積約為15mL的50%乙醇溶液直至完全溶解，并轉(zhuǎn)入100mL的容量瓶中定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（41.8mg/mL）。分別移取配制好的儲(chǔ)備液0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.00mL、2.50mL于6個(gè)10mL容量瓶中，各加入50%乙醇溶液至容量瓶體積的一半，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1.0mL，混合搖勻后放置8min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻放置8min，加入1mol/L的氫氧化鈉溶液5mL，混勻后用50%的乙醇定容，搖勻后放置15min。以空白瓶作為對(duì)照，在最大吸收波長處依次測定各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。

3.2 樣品中總黃酮的提取及含量測定

新采摘的杜仲原葉經(jīng)水洗自然晾干后于180℃下殺青3min，于80～90℃烘干，粉碎后過8目篩，得杜仲原葉粉末于4℃保存?zhèn)溆谩＞_稱取杜仲葉粉末1.0g，加入適量50%乙醇進(jìn)行超聲提取，將提取液離心，取上層清液于25mL容量瓶中。殘?jiān)貜?fù)進(jìn)行超聲提取、離心、收集上層清液，最后用50%乙醇定容即為杜仲原葉提取液。精確移取提取液5mL于25mL的容量瓶中，按3.1節(jié)所述方法進(jìn)行處理并測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液濃度，并按下式計(jì)算總黃酮提取率［9～11］。

其中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得提取液中總黃酮濃度（g/L）；M為稱取杜仲葉粉末的質(zhì)量（g）。

3.3 杜仲葉總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)

按照3.2中的實(shí)驗(yàn)方法，分別考察不同提取料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取效率的影響，得出最佳提取工藝的單因素條件［9，12，13］。

3.4 杜仲葉總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)

在已有的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上，選取其中3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。選取的三因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和超聲時(shí)間（C）。以總黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

4 結(jié)果與討論

4.1 蘆丁波長掃描

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液在400～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，蘆丁在510nm處吸光度最強(qiáng)，故選擇510 nm為檢測總黃酮含量的波長，如圖1所示。

4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照3.1節(jié)中的方法在510nm最大吸收波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)畫出濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=0.012x-0.0011，R2=0.9996。

4.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取條件

4.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

精確稱取杜仲葉粉末6份各1.0g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各10mL，在超聲功率為900W和40℃的條件下超聲浸提20min。研究乙醇濃度對(duì)杜仲葉中總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖3。

乙醇濃度在30%～50%之間，總黃酮的提取率隨乙醇濃度增大而上升，并在50%時(shí)達(dá)到最大值9.47%，之后隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率反而下降。這可能是由于乙醇濃度的增加使得混合溶劑的極性下降，溶劑與黃酮類物質(zhì)極性的相似程度降低，從而導(dǎo)致不利于黃酮類物質(zhì)的溶出。因此選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的溶劑濃度。

4.3.2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

精確稱取杜仲葉粉末5份各1.0g，選取料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16g/mL，乙醇濃度為50%，在超聲功率為900W和40℃條件下分別提取20min。研究不同料液比對(duì)杜仲葉中總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，液料比在1∶8～1∶14g/mL間總黃酮的提取率基本呈現(xiàn)一個(gè)緩慢的上升趨勢(shì)。當(dāng)料液大于1∶14g/mL以后，總黃酮的提取率呈明顯下降趨勢(shì)，最大提取率為8.5%。因此選擇料液比1∶14g/mL為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的料液比。

4.3.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

精確稱取杜仲葉粉末6份各1.0g，在乙醇濃度為50%，液料比為1∶14g/mL，超聲功率為900W和40℃條件下分別超聲5、10、15、20、25、30min。研究不同超聲時(shí)間對(duì)杜仲葉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖5。

隨著超聲時(shí)間的延長，總黃酮提取率開始呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢(shì)，并在提取時(shí)間增加到20min時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值8.70%。20min以后隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)增加，總黃酮的提取率開始緩慢減小。這可能是由于超聲時(shí)間過長，部分黃酮類物質(zhì)會(huì)被氧化或分解，反而影響提取效率。

4.3.4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

精確稱取杜仲葉粉末5份各1.0g，在乙醇濃度為50%，液料比1∶14g/mL，超聲功率為900W，溫度為40℃和超聲時(shí)間為20min條件下分別超聲提取1、2、3、4、5次。研究提取次數(shù)對(duì)杜仲葉總黃酮提取的影響，結(jié)果見圖6。

由圖可見隨著超聲提取次數(shù)的增加，杜仲葉中總黃酮的提取率總體上呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，從第1次到第3次提取總黃酮提取率增加了6.4%，而經(jīng)過了3次提取以后總黃酮的提取率增加變得平緩，這說明3次提取以后重復(fù)提取的效率開始明顯變低。因此綜合考慮提取成本和效率的問題提取次數(shù)選擇3次比較合適。

4.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，按照表1中所設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行三因素正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2結(jié)果分析可見，在我們所選取的3個(gè)因素中影響總黃酮提取率的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即液料比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間，故料液比是影響本工藝對(duì)杜仲葉中黃酮提取的主要因素。因此，通過以上實(shí)驗(yàn)得出本工藝對(duì)杜仲葉總黃酮提取的最佳條件為：乙醇濃度50%，液料比1∶14g/mL，超聲時(shí)間20min，且提取次數(shù)為3次。

5 結(jié)語

本文采用超聲波提取法對(duì)杜仲葉中總黃酮進(jìn)行了提取探索實(shí)驗(yàn)，考查乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)四個(gè)因素對(duì)總黃酮提取效果的影響，并選取其中三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)確定了總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇濃度50%，液料比1∶14g/mL，超聲時(shí)間20 min且提取次數(shù)為3次為宜。

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