硫氧環蛋白過氧化物酶3對血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大的影響

趙霞 梁婷婷 裴強 王洪波范玉磊 魏中秋 馮莉 孫影▲

1.河北聯合大學冀唐學：醫學實驗中心，河北唐山063300；2.河北聯合大學基礎醫學：病理學系，河北唐山063000；3.河北聯合大學附屬遵化市人民醫院心內科，河北唐山064200；4.河北聯合大學附屬遵化市人民醫院外科，河北唐山064200

硫氧環蛋白過氧化物酶3對血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大的影響

趙霞1梁婷婷2裴強3王洪波4范玉磊2魏中秋2馮莉2孫影2▲

1.河北聯合大學冀唐學：醫學實驗中心，河北唐山063300；2.河北聯合大學基礎醫學：病理學系，河北唐山063000；3.河北聯合大學附屬遵化市人民醫院心內科，河北唐山064200；4.河北聯合大學附屬遵化市人民醫院外科，河北唐山064200

目的觀察硫氧環蛋白過氧化物酶3（Prdx-3）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導心肌細胞肥大中的作用，并探討其作用機制。方法體外培養心肌細胞（H9C2）隨機分為對照組、AngⅡ組、AngⅡ+轉染對照組和AngⅡ+Prdx-3轉染組。脂質體轉染法將Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞，Western blot法檢測Prdx-3蛋白表達，Real-time PCR法檢測腦鈉素（BNP）mRNA表達，二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測活性氧（ROS）水平。結果Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞后，Prdx-3蛋白表達值為（0.88±0.12），高于轉染對照組（0.38±0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，AngⅡ組BNP mRNA[（1.00±0.00）比（1.72±0.29）]、ROS[（3473±81）比（4439±111）]及Prdx-3蛋白表達水平[（0.33±0.05）比（0.72±0.14）]均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。AngⅡ+轉染對照組和AngⅡ組的BNP mRNA[（1.72±0.29）比（1.94±0.34）]、ROS[（4439±111）比（4285±167）]及Prdx-3蛋白水平[（0.72± 0.14）比（0.75±0.11）]比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Prdx-3轉染組BNP mRNA [（1.72±0.29）比（1.29±0.15）]和ROS水平[（4439±111）比（3648±254）]明顯下降，但Prdx-3蛋白水平[（0.72±0.14）比（1.89±0.37）]顯著增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論AngⅡ可通過ROS誘導心肌細胞肥大，而Prdx-3通過降低ROS抑制AngⅡ的作用。

硫氧環蛋白過氧化物酶3；活性氧；心肌肥大；血管緊張素Ⅱ

高血壓性心臟病主要病理表現是心肌肥大，但持續性心肌肥大會導致心力衰竭。筆者前期研究發現，在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的高血壓模型中，心肌組織中活性氧（ROS）水平明顯增高，氧化反應被過度激活；增高的ROS通過參與異常的細胞內信號傳導通路或損傷DNA、蛋白質、脂質等物質促進細胞增殖、肥大、凋亡等[1-2]。硫氧環蛋白過氧化物酶3（Peroxiredoxin-3，Prdx-3）是一種新型過氧化物酶，存在于線粒體，與硫氧還蛋白2（thioredoxin-2，Trx-2）一起清除來自于線粒體的ROS[3]。Prdx-3在多種病理過程中均表達上調，以減少組織氧化應激損傷[4]。但在高血壓誘導的心肌肥大中，Prdx-3是否可被激活并對心肌肥大進行調控，目前報道較少。本研究利用AngⅡ刺激正常或Prdx-3表達質粒轉染的心肌細胞，通過檢測腦鈉素（BNP）、ROS和Prdx-3等指標的變化，探討Prdx-3在AngⅡ誘導心肌肥大過程中的作用及機制，為Prdx-3成為靶向治療新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2大鼠心肌細胞（中國科學：上海生命科學研究：）；血管緊張素Ⅱ（Sigma公司產品）；Prdx-3表達質粒（上海吉瑪公司合成）；BNP上下游引物（上海吉瑪公司合成）；M-MLV逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；SYBR+Tap混合劑（美國Invitrogen公司）；Prdx-3抗體（美國Abcam產品）；二氯熒光素二乙酸（Sigma公司）。

1.2 細胞培養及實驗分組

心肌細胞在含10%胎牛血清濃度的杜爾伯科改良伊格爾培養基（DMEM）中常規培養，達到70%融合后分為四組。①對照組：以0.4%血清濃度DMEM孵育細胞；②AngⅡ組：0.4%血清濃度DMEM培養條件下，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細胞；③AngⅡ+轉染對照組：脂質體Lipo 2000將空質粒載體轉染心肌細胞24 h，0.4%血清濃度DMEM培養12 h（同步化）后，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細胞；④AngⅡ+Prdx-3轉染組：脂質體Lipo 2000將Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞24 h，0.4%血清濃度DMEM培養12 h，給予AngⅡ（1×10-6mol/L）孵育細胞。

1.3 Western blot法檢測Prdx-3在心肌細胞內的表達

各組細胞同步化后經或未經AngⅡ刺激30 min，PBS漂洗，細胞裂解液冰上震蕩裂解30 min后收集裂解細胞，低溫高速離心15 min，收集上清。考馬斯亮藍R-250染色測定蛋白濃度，每孔50 μg上樣并電泳和轉膜。5%牛血清白蛋白封閉1 h，Prdx-3抗體（1∶1000稀釋）4℃孵育過夜。次日，二抗（1∶3000稀釋）室溫孵育2 h后，BCIP/NBT（1∶50稀釋）顯色3 min。Image J軟件對蛋白表達條帶進行灰度定量分析，以Prdx-3與GAPDH灰度比值作為Prdx-3表達值。

1.4 Real time PCR法檢測BNP mRNA表達[5]

各組細胞同步化后經或未經AngⅡ刺激24 h，Trizol提取細胞總RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆轉錄。1 μL cDNA進行Real-time PCR擴增，擴增體系如下：SYRB+Taq混合劑10 μL、Prx-1或GAPDH上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水8 μL；擴增條件：95℃變性30 s后，95℃變性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環。BNP上游引物序列5'-TGGGCAGAAGATAGACCGGA-3'，下游引物5'-ACAA CCTCAGCCCGTCACAG-3'；GAPDH上游引物5'-GGC ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游引物5'-ATGGTG GTGAAGACGCCAGTAA-3'。GAPDH為內參照，各組BNP mRNA表達量以各樣本與對照組的倍數表示。

1.5 二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測ROS水平

DCFH-DA沒有熒光，能自由穿過細胞膜，進入細胞后被酯酶水解生成還原型二氯熒光素（DCFH），DCFH不能通過細胞膜，但可被細胞內的ROS氧化生成氧化型二氯熒光素（DCF），DCF可發出熒光，因此DCF的熒光量可以反映細胞內ROS水平。本實驗細胞同步化后，AngⅡ刺激20 min，經0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min，PBS洗3次，計數10 000個細胞，在熒光酶標儀測定激發波長488 nm、發射波長525 nm處的熒光強度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 15.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞后Prdx-3蛋白表達

心肌細胞（未經AngⅡ刺激）經空質粒或Prdx-3表達質粒轉染24 h后，Western blot檢測Prdx-3蛋白表達。結果顯示，轉染對照組Prdx-3蛋白表達值為（0.38±0.05），Prdx-3表達質粒轉染后Prdx-3蛋白表達值為（0.88±0.12），是轉染對照組的2.3倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 BNP mRNA表達

與對照組比較，AngⅡ組BNP mRNA表達增高[（1.72±0.29）比（1.00±0.00）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；AngⅡ組與AngⅡ+轉染對照組[（1.94±0.34）]比較，BNP mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉染組BNP mRNA表達（1.29±0.15）明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 Western blot法檢測Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞后Prdx-3蛋白表達

2.3 ROS水平

對照組熒光強度為（3473±81），AngⅡ組熒光強度為（4439±111），差異有統計學意義（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+轉染對照組熒光強度為（4285±167），差異無統計學意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉染組熒光強度為（3648±254），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 Prdx-3蛋白表達

對照組Prdx-3蛋白的表達值為（0.33±0.05），AngⅡ組Prdx-3蛋白表達值為（0.72±0.14），差異有統計學意義（P＜0.05）。與AngⅡ組比較，AngⅡ+轉染對照組Prdx-3蛋白的表達值為（0.75±0.11），差異無統計學意義（P＞0.05），但AngⅡ+Prdx-3轉染組的Prdx-3蛋白的表達值為（1.89±0.37），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組細胞Prdx-3蛋白表達情況

3 討論

ROS包括氧自由基、過氧化物和激發態氧等，具有很高的化學活性。正常時體內ROS的濃度很低，對機體具有保護作用，但過多的ROS可導致脂質過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質修飾變性，從而導致細胞凋亡和壞死[6]。另外，過多ROS還與心肌細胞肥大密切相關。研究表明，ROS是細胞信號傳導通路的重要成員，通過激活細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及核因子κB（NF-κB）等途徑介導多種細胞因子或活性因子的促心肌細胞肥大作用[7]。線粒體是心肌細胞產生ROS的重要場所，主要通過線粒體呼吸鏈電子泄漏產生[3]。最近研究顯示，心臟微環境內的腎素-血管緊張素-醛固酮系統還可通過誘導ATP±賴的K+離子通道開放來促進線粒體產生更多的ROS，并由此引起Ⅰ型鈉氫交換體和碳酸氫鈉協同轉運蛋白的激活，最終引起心肌細胞肥大[8]。

Peroxiredoxin家族是一種新型的過氧化物酶，Prdx-3是該家族成員中唯一特異性定位于線粒體的酶蛋白，在內質網中合成后經過線粒體定位信號轉運到線粒體。Prdx-3、Trx2及硫氧還蛋白還原酶2（TrxR2）一起構成Prdx-3-Trx-TrxR氧化還原體系，催化來自線粒體的H2O2轉變成H2O，從而調控線粒體內H2O2濃度水平，保護細胞免于來自線粒體的氧化應激[9-10]。有研究顯示，Prdx-3能夠保護肝癌細胞免于氧化應激誘導的細胞凋亡[11]，高表達Prdx-3在毒物誘導的大鼠海馬區神經損傷中發揮保護作用[12]。在本研究中，AngⅡ刺激心肌細胞30 min后Prdx-3蛋白表達明顯高于對照組，說明AngⅡ能夠上調心肌細胞Prdx-3表達。

本研究利用Prdx-3表達質粒轉染心肌細胞使心肌細胞高表達Prdx-3蛋白，并觀察高表達Prdx-3對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大和ROS的影響。結果發現，AngⅡ使心肌細胞BNP mRNA的水平增加了1.7倍，Prdx-3表達質粒轉染后BNP mRNA的水平下降了23.5%（P＜0.05），而轉染對照無明顯變化，提示Prdx-3高表達能抑制AngⅡ誘導心肌細胞肥大。同時，高表達Prdx-3對AngⅡ誘導的ROS也有抑制作用，AngⅡ作用20 min后ROS的表達量較對照組明顯增加，Prdx-3表達質粒轉染后ROS水平下降，說明Prdx-3可通過抑制ROS來抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。

綜上所述，AngⅡ可通過ROS誘導心肌細胞肥大，高表達Prdx-3通過降低ROS水平來抑制AngⅡ促心肌細胞肥大作用。因此，Prdx-3有望成為心肌肥大基因治療的新靶點。

[1]Sun Y，Carretero OA，Xu J，et al.Deletion of Inducible Nitric Oxide Synthase Provides Cardioprotection in Mice With 2-Kidney，1-Clip Hypertension[J].Hypertension，2009，53（1）：49-56.

[2]Xuan CL，Yao FR，Guo LR，et al.Comparison of extracts from cooked and raw lentil in antagonizing angiotensinⅡ-induced hypertension and cardiac hypertrophy[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（19）：2644-2653.

[3]王大寧.PrxⅢ在去甲腎上腺素誘導H9C2細胞凋亡過程中的表達變化[D].石家莊：河北醫科大學，2008.

[4]Li L，Zhang YG，Chen CL，et al.Anti-apoptotic role of peroxiredoxinⅢin cervical cancer cells[J].FEBS Open Bio，2012，22（3）：51-54.

[5]高衛民，曹志鵬，米麗，等.急性心功能障礙大鼠心肌中BNP的表達[J].法醫學雜志，2013，29（2）：86-90.

[6]蘇麗華，王璇琳，賀敏，等.黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[J].中國醫藥導報，2014，11（12）：21-24.

[7]Chen G，Pan SQ，Shen C，et al.Puerarin inhibits angiotensinⅡ-induced cardiac hypertrophy via the redox-sensitive ERK1/2，p38 and NF-κB pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2014，35（4）：463-475.

[8]De Giusti VC，Caldiz CI，Ennis IL，et al.Mitochondrial reactive oxygen species（ROS）as signaling molecules of intracellular pathways triggered by the cardiac renin-angiotensinⅡ-aldosterone system（RAAS）[J].Front Physiol，2013，4：126-134.

[9]Li L，Shoji W，Oshima H，et al.Crucial role of peroxiredoxinⅢin placental antioxidant defense of mice[J].FEBS Lett，2008，5（82）：2431-2434.

[10]Matsushima S，Ide T，Yamato M，et al.Overexpression of mitochondrial peroxiredoxin-3 prevents left ventricular remodeling and failure after myocardial infarction in mice[J].Circulation，2006，1（13）：1779-1786.

[11]Wang YG，Li L，Liu CH，et al.Peroxiredoxin 3 is resistant to oxidation-induced apoptosis of Hep-3b cells[J]. Clin Transl Oncol，2014，16（6）：561-566.

[12]Hattori F，Murayama N，Noshita T，et al.Mitochondrial peroxiredoxin-3 protects hippocampal neurons from excitotoxic injury in vivo[J].J Neurochem，2003，86（4）：860-868.

Effect of Peroxiredoxin-3 on angiotensinⅡ-induced cardiomyocytes hypertrophy

ZHAO Xia1LIANG Tingting2PEI Qiang3WANG Hongbo4FANG Yulei2WEI Zhongqiu2FENG Li2SUN Ying2▲
1.Medical Research Center,Jitang College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063300,China;2.Department of Pathology,Primary Medicine College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000,China; 3.Department of Cardiology,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200, China;4.Department of Surgery,Zunhua People's Hospital,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan 064200,China

Objective To study the effect of peroxiredoxin-3(Prdx-3,a noval type of peroxidase)on AngiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiomyocytes hypertrophy and explore the precious mechanism.Methods Cultured cardiomyocytes (H9C2)were randomly divided into four groups:control group,AngⅡgroup,AngⅡ+vehicle(plasmid without prdx-3 gene)group,AngⅡ+Prdx-3 plasmid group.Prdx-3 was transfected into cardiomyocytes using the liposome infection. Western blot was used to evaluate Prdx-3 expression in cardiomyocytes,while levels of brain natriuretic peptide(BNP) mRNA and reactive oxygen species(ROS)were measured by Real-time PCR and DCFH-DA.Results The expression of Prdx-3 protein in transfected cardiomyocytes(0.88±0.12)was significantly higher than vehicle(0.38±0.05,P＜0.05). Compared with control group,expressions of BNP mRNA,ROS and Prdx-3 in AngⅡgroup all increased[(1.00±0.00) vs(1.72±0.29),(3473±81)vs(4439±111),(0.33±0.05)vs(0.72±0.14),P＜0.05].The difference of expressions of BNP mRNA[(1.72±0.29)vs(1.94±0.34)],ROS[(4439±111)vs(4285±167)]and Prdx-3[(0.72±0.14)vs(0.75±0.11)]between AngⅡand AngⅡ+vehicle groups were not statistically significant(P＞0.05).Compared with AngⅡ,expressions of BNP mRNA and ROS in AngⅡ+Prdx-3 plasmid group were lower[(1.72±0.29)vs(1.29±0.15),(4439±111)vs(3648± 254),P＜0.05],while Prdx-3 level was further higher[(0.72±0.14)vs(1.89±0.37),P＜0.05].Conclusion AngⅡinduced cardiomyocytes to generate ROS,which contributes to cell hypertrophy;however,Prdx-3 over-expression inhibits these changes by decreasing ROS level.

Peroxiredoxin-3;Reactive oxygen species; Cardiomyocytes hypertrophy;AngiotensinⅡ

R542.2

A

1673-7210（2015）07（c）-0018-04

2015-02-14本文編輯：程銘）

河北省引進留學人員科技活動項目（D2012003028）。

▲通訊作者