人乳頭狀瘤病毒E6、E7蛋白在維吾爾族及漢族宮頸癌發展中的表達及意義

王琳 韓莉莉 瑪依努爾·尼牙孜 隋霜

新疆維吾爾自治區人民醫院婦科，新疆烏魯木齊830001

人乳頭狀瘤病毒E6、E7蛋白在維吾爾族及漢族宮頸癌發展中的表達及意義

王琳 韓莉莉 瑪依努爾·尼牙孜▲隋霜

新疆維吾爾自治區人民醫院婦科，新疆烏魯木齊830001

目的分析維吾爾族及漢族宮頸癌患者中人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6、E7蛋白表達與宮頸癌癌前病變惡性進展的關系，進一步了解其在維吾爾族及漢族宮頸癌患者間是否存在差異。方法選取2013年4月～2014年4月在新疆維吾爾自治區人民醫院婦科門診行第二代雜交捕技術HPV DNA檢測結果為陽性的133例維吾爾族（n= 75）和漢族（n=58）患者宮頸不同病變程度的石蠟包埋宮頸組織。采用免疫組化法分別檢測各組織中HPV E6、E7蛋白表達，使用Spearman等級相關分析HPV E6、E7蛋白表達與病變程度的相關性，并采用χ2檢測比較維吾爾族及漢族宮頸癌患者HPV E6、E7蛋白表達的差異。結果維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中HPV E6的陽性率，隨著病情的進展呈逐漸增高趨勢，差異均有統計學意義（χ2=39.61，P=0.001；χ2= 19.77，P=0.001）；Spearman等級相關分析發現，維吾爾族及漢族宮頸癌患者HPV E6蛋白的表達與宮頸病變級別均呈顯著正相關（r=0.708，P=0.001；r=0.729，P=0.001）、HPV E7在維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率，隨著病情的進展呈逐漸增高，多組比較差異有統計學意義（χ2=32.48，P=0.001；χ2= 24.16，P=0.001）；Spearman等級相關分析發現，維吾爾族及漢族宮頸癌患者E6蛋白表達與宮頸病變級別均呈顯著正相關（r=0.649，P=0.001；r=0.759，P=0.001）；慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3維吾爾族患者HPV E6、E7蛋白的陽性表達率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者HPV E6、E7蛋白表達率低于漢族，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論HPV E6、E7蛋白是維吾爾族和漢族宮頸癌發展的重要因素，HPV E6、E7蛋白可能具有預測宮頸病變進展的價值。

人乳頭狀瘤病毒曰E6蛋白曰E7蛋白曰宮頸癌曰維吾爾族曰漢族

高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續感染是宮頸癌及宮頸病變發生發展的必要條件[1]。HPV感染在人群中具有普遍性，并且感染型別也不盡相同[2-3]。HPV致癌的分子機制主要與其表達的E6、E7蛋白有關。HPV早期基因E6和E7不僅可以結合被感染宿主細胞的DNA，同時還與細胞內的抑癌基因p53和pRb分別結合，抑制或降低p53和pRb的抑癌功能，促進細胞轉化和癌細胞發生[4-6]。新疆在中國的西北邊陲，是宮頸癌高發地區之一，并且維吾爾族婦女位居全國少數民族首位[7]，并且近2/3就診的維吾爾族宮頸癌患者已達到中晚期[8]，目前維吾爾族婦女宮頸癌高發的原因尚不清楚。本研究采用免疫組化方法檢測維吾爾族和漢族婦女慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasm，CIN）及宮頸鱗癌組織中的HPV E6、E7蛋白的表達情況，探討維吾爾族和漢族中HPV E6、E7蛋白表達與宮頸癌前病變惡性進展的關系，并進一步了解其在維吾爾族及漢族宮頸癌患者間是否存在差異，為尋找維吾爾族宮頸癌高發的原因和發現能夠預測CIN轉歸的分子標志物作一初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2014年4月在新疆維吾爾自治區人民醫院婦科門診行第二代雜交捕技術（Hybrid capture 2，HC-Ⅱ）HPV DNA檢測的婦女中，選取高危型HPV陽性且有宮頸組織病理學診斷、已婚無全子宮切除手術史、未婚而有性生活史，且調查前6個月內無宮頸及陰道手術治療史、CIN和宮頸癌病史、自身免疫性疾病或口服免疫抑制劑、急性生殖道炎癥的婦女。納入研究對象133例，包括維吾爾族75例和漢族58例，年齡25～81歲，平均（41.2±2.1）歲。根據最終組織病理學，包括漢族慢性宮頸炎11例，CIN 1 13例，CIN 2～3 18例，宮頸鱗癌16例；維吾爾族慢性宮頸炎19例，CIN 1 9例，CIN 2～3 22例，宮頸鱗癌25例。本研究經我院醫學倫理委員會批準，且所有參與實驗者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

采用免疫組化檢測HPV16 E6、E7蛋白表達，納入研究對象的宮頸組織樣本均做常規HE染色，由高年資病理醫生對HE染色切片進行組織學觀察和復診，并進行病理分級，宮頸癌病理診斷標準參照《婦產科病理學》。采用Envision法檢測宮頸石蠟包埋組織中HPV 16 E6、E7蛋白的表達，一抗為鼠抗人HPV16 E6、E7單克隆抗體（SC-460，美國Santa Cruz公司），工作濃度為1∶100，實驗步驟按免疫組化Envision試劑盒（DAKO公司）說明書進行。用已知陽性的宮頸癌標本作陽性對照，用已知陰性的正常宮頸標本作陰性對照，用PBS緩沖液代替一抗作空白對照。

1.3 判讀標準

檢測結果判定：細胞核棕黃色為染色陽性，隨機選取10個視野，400倍鏡下觀察每個視野中20個細胞，共計200個細胞，以陽性細胞數＞10%判為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman秩相關檢驗分析HPV E6、E7 DNA蛋白表達和宮頸病變級別的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維吾爾族及漢族不同病變程度的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白的表達情況及其相關性分析

隨著病情的進展，HPV E6在維吾爾族及漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率呈逐漸增高趨勢，差異均有高度統計學意義（χ2= 39.61，P=0.001；χ2=19.77，P=0.001）；Spearman等級相關分析結果顯示，維吾爾族及漢族HPV E6蛋白表達與宮頸病變程度均呈顯著正相關（r=0.708，P=0.001；r=0.729，P=0.001）。隨著病情的進展，HPV E7在維吾爾族及漢族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中的陽性表達率呈逐漸增高趨勢，差異均有高度統計學意義（χ2=32.48，P=0.001；χ2=24.16，P=0.001）；Spearman等級相關分析結果顯示，HPV E7蛋白表達與宮頸病變程度均呈顯著正相關（r=0.649，P=0.001；r=0.759，P=0.001）。見表1。

2.2 維吾爾族及漢族不同病理級別的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白陽性表達率比較

維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3患者宮頸組織中E6蛋白的陽性表達率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者E6蛋白的陽性表達率低于漢族，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3患者宮頸組織中E7蛋白的陽性表達率高于漢族，維吾爾族宮頸癌患者E7蛋白的陽性表達率低于漢族，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

眾多研究顯示，高級鱗狀上皮內瘤變及宮頸癌中E6和E7蛋白的表達水平顯著提高，表明E6及E7蛋白的表達水平與宮頸病變的進展程度及細胞的惡性轉化密切相關。高危型HPV感染后病毒癌蛋白E6、E7發揮調解細胞凋亡的作用。新疆南部的維吾爾族是宮頸癌的高發地區，發病率及死亡率均高于同一地理環境的其他少數民族[9-10]。是否在維吾爾族和漢族宮頸病變惡性進展過程中E6、E7蛋白表達存在差異，目前尚沒有明確報道。故本研究采用免疫組化方法檢測維吾爾族和漢族慢性宮頸炎、CIN、宮頸鱗癌組織中的HPV E6、E7蛋白表達情況，初步探索維吾爾族宮頸癌高發的原因。

表1 漢族及維吾爾族不同病變程度的宮頸組織中HPV E6、E7蛋白在的表達情況[%（n1/n2）]

HPV E6蛋白由150個氨基酸構成，在各個型別HPV的E6蛋白具有同源的的氨基酸，其共同特征都存在Cys-x-x-Cys鋅指結構，這種鋅指結構與其功能如惡性轉化的作用、轉錄激活及細胞蛋白間相互作用等密切相關。E6通過E6關聯蛋白（E6 associated protein，E6-AP）與P53結合，降解P53可影響到細胞內的多條信號途徑，從而影響細胞周期。本研究結果發現，HPV E6蛋白的表達在維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織的陽性率隨著病情的進展呈逐漸增高趨勢，并且HPV E6蛋白表達與宮頸病變級別具有顯著相關。在漢族中，也發現了相同的趨勢。

本研究結果提示HPV E6蛋白在宮頸病變的早期發揮作用。在HPV感染的宮頸各個級別病變中，宮頸癌E6蛋白的檢出率接近100%，在慢性宮頸炎組和CIN 1組的蛋白表達率不足50%，HPV E6蛋白的表達可能在一定程度上解釋宮頸低度病變仍然大部分能夠逆轉[11]，而CIN 2～3病變的HPV E6的表達率達75%左右，進一步發展成宮頸癌的比例大，提示宮頸病變的病情進展或轉歸可能與E6蛋白的表達有關。李惠新等[12]也使用免疫組化的方法也發現宮頸高度病變和宮頸癌E6蛋白的表達率高，與本研究結果一致。目前液基薄層細胞學檢測聯合HPV檢查具有較好的篩查效果[13-14]，在此基礎上結合E6蛋白的表達可能更有助于判斷HPV感染的預后[10]。

HPV E7蛋白由100個氨基酸構成，含有3個功能區，具有鋅指結構。其主要功能是能夠與Rb蛋白結合，使靜止的G0期細胞進入細胞周期進行有絲分裂。與E6協同作用導致細胞發生永生化。本研究結果也發現，HPV E7在維吾爾族慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3、宮頸鱗癌組織中陽性表達率隨著病情的進展呈逐漸增高趨勢，并且HPV E7蛋白表達與宮頸病變級別具有顯著相關。在漢族中，也發現了相同的趨勢。提示在維吾爾族宮頸癌發生發展過程中，E7蛋白可能在HPV致癌的早期過程，CIN發生發展的早期階段發揮重要作用。本研究CIN 1的表達率在25%左右，可見在早期CIN階段E7蛋白已明顯表達。維吾爾族宮頸癌的發生發展的過程中，HPV E6、E7均發揮重要作用。

在維吾爾族及漢族的對比研究中，雖然相同級別宮頸病變中HPV E6蛋白表達在維吾爾族和漢族之間差異無統計學意義，但本研究仍然觀察到在慢性宮頸炎、CIN 1、CIN 2～3維吾爾族患者中，HPV E6蛋白的陽性表達率高于漢族，并且HPV E7基因也發現相同的現象。維吾爾族在宮頸癌前各個級別病變中的HPV E6、E7的表達高于漢族，而HPV E6、E7蛋白高表達提示病程進展，可能在HPV感染導致宮頸病變過程中，維吾爾族婦女相對不容易逆轉，更容易進一步進展。王薇等[15]使用實時定量的方法檢測維吾爾族和漢族E6、E7的載量，發現HPV E6、E7與維吾爾族和漢族宮頸病情進展相關，具有預測宮頸病變轉歸的作用。近年來有學者通過檢測E6、E7 mRNA的轉錄來診斷和預測宮頸癌的發生，具有一定的診斷價值[16-17]，也說明在宮頸癌發生過程HPV E6、E7蛋白表達影響宮頸病變的進展。但HPV E6、E7在致癌過程中如何作用還需要進一步分子生物學研究。

綜上所述，HPV E6、E7蛋白是維吾爾族和漢族宮頸癌發展的重要因素，HPV E6、E7蛋白可能具有預測宮頸病變進展的價值。

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Expression of HPV E6/E7 proteins in cervical carcinoma of Uygur and Han women and its significance

WANG LinHAN LiliMayinuer·Niyazi▲SUI Shuang
Department of Gynecology,the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi830001,China

Objective To analyze the relation between the expression of HPV E6/E7 gene and cervical cancer progression in Uyghur and Han women and to compare the difference expression of HPV E6/E7 gene between Uygur and Han women.Methods Total of 133 paraffin-embedded tissues of cervix were collected from the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region from April 2013 to April 2014 were recruited,and all the cases were confirmed by the histological diagnosis.Immuno-histochemistry was performed to detect the expressions of HPV16 E6 and E7 proteins including 75 Uygur and 58 Han.The correlation between expression of HPV E6,E7 protein and lesion grade of cervical was analyzed by spearman rank correlation,and to compare the difference of HPV E6,E7 protein expression between Chinese and Uygur by χ2trest.Results The expression rate of HPV E6 proteins were increased with the development of from chronic inflammation to caner in Uygur and Han women,respectively,there were significant difference (χ2=39.61,P=0.001;χ2=19.77,P=0.001);further using Spearman rank correlation found the significant positive correlation between expression of E7 proteins and lesion grade of cervical(r=0.708,P=0.001;r=0.729,P=0.001).The expression rate of HPV E7 proteins were increased with the disease development from chronic inflammation to caner in Uygur and Han women,respectively,there were significant differences(χ2=32.48,P=0.001;χ2=24.16,P=0.001),further using Spearman rank correlation found significant positive correlation between expression of E7 proteins and lesion grade of cervical(r=0.649,P=0.001;r=0.759,P=0.001).In the inflammatory group,CIN 1,CIN 2-3,positive expression rate of E6,E7 protein in Uygur women was higher than that of Han women;in cervical cancer group,the expression rate of E6,E7 protein in Uygur women was lower than that of Han women,but the difference was not statistically significant(P＞0.05).Conclusion HPV E6,E7 protein were important factors in the development of cervical cancer in Uygur and Han women.HPV E6,E7 proteins may have a prediction value in development of cervical lesion.

HPV;E6 protein;E7 protein;Cervical cancer;Uygur nationality;Han nationality

R737.33

A

1673-7210（2015）07（c）-0075-04

2015-03-02本文編輯：任念）

新疆維吾爾自治區人民醫院：內課題（2011 0106）。

▲通訊作者